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结果： 作者研究的整个工作流程如图1所示。对于DEM，从GSE103708数据集中筛选出了192个DEM（32个上调和160个下调），而从GSE76449中筛选出了201个DEM（72个上调和129个下调）（图2A）。如图2B所示，选择了GSE103708和GSE76449中的14个重叠miRNA作为DEM（3个上调和11个下调）。对于DEG，分别从GSE54388、GSE17308、GSE12470和GSE6008中筛选出了8729个DEG（5452个上调和3277个下调）、1526个DEG（760个上调和766个下调）、5765个DEG（4324个上调和1441个下调）和6494个DEG（3328个上调和3166个下调）。选择了GSE54388、GSE17308、GSE12470和GSE6008中的重叠mRNA作为DEG。最后，筛选出了101个DEG（67个上调和34个下调）（图3A、3B）。然后，这些DEM和DEG将用于接下来的分析。
GO分析结果显示共有101个差异表达基因（DEGs）映射到GO术语。使用虚假发现率（FDR）校正的P值<0.05和富集得分>1.5作为阈值，在BP、CC和MF术语中鉴定出显著富集的功能簇（如图4A所示）。在BP组中，DEGs主要富集于与细胞周期相关的过程和营养代谢，例如“DNA复制”、“依赖于DNA的DNA复制”、“对氨基酸的响应”。在CC组中，DEGs主要富集于“焦点粘附”、“细胞-基质连接”。在MF组中，DEGs主要富集于“糖胺聚糖结合”、“钙粘附蛋白结合”。对于KEGG富集分析，DEGs主要富集于“碱基切除修复”、“氨基酸生物合成”、“碳代谢”、“DNA复制”，同时还富集于一些信号通路，如“Ras信号通路”和“PI3K-Akt信号通路”（图4B）。
如图5A所示的miRNA-mRNA网络，两个重叠的基因FYCO1和嘌呤富集元素结合蛋白A（PURA）受到三个差异表达miRNA（hsa-miR-17-5p，hsa-miR-20b-5p和hsa-miR-20a-5p）的调控。有趣的是，这三个miRNA在卵巢疾病的外泌体组织中上调，而这两个mRNA下调。这些结果表明，来自卵巢组织的外泌体携带的miRNA可能调控卵巢中一些关键mRNA的表达。
miRNA-mRNA调控网络中miRNA和mRNA的验证通过GEPIA2在线数据库对FYCO1和PURA在正常组织和卵巢癌样本中的表达水平进行了验证。然而，尽管根据TCGA和基因组组织表达（GTEx）项目的基因表达谱，这两个mRNA在卵巢癌组织中的表达被下调（如图5B所示），但只有FYCO1表达的下调具有统计学意义。最后，基于GEPIA2数据库，卵巢癌患者的癌组织和健康人群的正常组织中FYCO1和PURA的表达趋势与基于GEO数据库的结果一致。验证中心基因FYCO1和PURA对卵巢癌患者生存的影响Kaplan-Meier绘图分析显示，高FYCO1表达与卵巢癌患者的总生存期（P=0.001）（图6A）和无进展生存期（P<0.001）（图6B）显著相关，使用的探针为affymetrix id为1555523_a_at。然而，当使用不同的探针，即id为218204_s_at时，FYCO1表达水平与卵巢癌患者的总生存期（P=0.33）（图6C）和无进展生存期（P=0.071）（图6D）没有显著相关。无论选择的探针是204020_at、204021_s_at、213806_at还是229167_at，PURA表达水平与卵巢癌患者的生存期无关。GEPIA2分析显示，FYCO1（P=0.33）和PURA（P=0.26）的表达与卵巢癌患者的总生存期无关（如图S1所示）。
通过荧光酶报告基因实验来确认潜在的结合关系。野生型和突变型FYCO1 3'UTR被插入荧光酶报告载体Con245中（图7A，7B），并与miR-17-5p模拟物共转染到HEK-293A细胞中。与模拟物NC组相比，转染miR-17-5p模拟物后，野生型FYCO1 3'UTR转染组的荧光酶活性显著降低，而突变型FYCO1 3'UTR转染组则没有显著差异（图7C）。为进一步研究miR-17-5p是否抑制内源性FYCO1表达，将miR-17-5p模拟物转染到SKOV-3细胞中，结果显示明显抑制了FYCO1转录本的表达（图7D）。这些结果证实了miR-17-5p在卵巢细胞中靶向FYCO1。
总结 通过构建一个新的 miRNA-mRNA 网络，我们可以对驱动卵巢癌中的外泌体的分子机制有新的认识。针对源自外泌体的 FYCO1 可能作为卵巢癌的诊断标志物具有潜力。
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