|
摘 要 为揭示鬼笔属真菌子实体各器官的发育过程和形态特点，采用石蜡切片法对驯化栽培出菇的超短裙竹荪Phallus ultraduplicatus、冬荪P. dongsun和红托竹荪P. rubrovolvatus不同发育阶段的菇蕾进行切片显微观察，结合菌丝、孢子和子实体形态比较3个种的个体发育及形态特点。结果表明：3个种的菌丝和孢子形态差异不明显，超短裙竹荪子实体的菌裙质地较薄、长约4 cm、带有不规则形状的网孔；红托竹荪的菌裙质地较厚、长约7 cm、带有圆形网孔；冬荪仅有1层薄菌幕。3个种的菇蕾内部发育顺序一致，最先发育的都是胶质腔，接着是子实层、菌柄腔、菌盖、菌柄、菌裙（菌幕）；发育过程中菌丝形态经历从疏松到紧密、从交织状到组织状的变化过程；各器官发育完成的时间不同，在菇蕾直径相同的条件下，冬荪发育最快，在菇蕾直径为2 cm时，各器官基本发育完成，红托竹荪在菇蕾直径为3 cm时发育完成，超短裙竹荪的菇蕾发育最慢，在直径达到4 cm时各器官才能发育完成。为鬼笔类真菌的分类研究和亲缘关系探索提供了依据。关键词 超短裙竹荪；冬荪；红托竹荪；菇蕾；石蜡切片鬼笔属Phallus真菌隶属于担子菌门Basidiomycota、蘑菇纲Agaricomycetes、鬼笔目Phallales、鬼笔科Phallaceae。目前在我国分布并被报道的有29种，主要分布于西南、华南地区，其中大多数种类可食用。以往人们习惯把带有网格状菌裙的种类归于竹荪属Dictyophora，没有菌裙的归于鬼笔属Phallus。Kreisel认为鬼笔属种类中在菌盖的内层也存在着已经退化的菌裙结构，因而鬼笔属和竹荪属的种类在形态结构上没有本质的区别。1911年Atkinson对白鬼笔P. impudicus、雷氏鬼笔P. ravenelii和短裙竹荪D. duplicata在菇蕾发育过程中菌幕的形成起源进行研究，发现在菇蕾形成的初期，白鬼笔和雷氏鬼笔均有与短裙竹荪菌裙结构类似的菌幕组织，而在菇蕾接近成熟时，白鬼笔的菌幕逐渐退化凋零而被误认为无菌幕，雷氏鬼笔的菌幕在整个菇蕾发育过程中未发生退化。多数学者研究鬼笔类真菌的形态发育时所采用的材料均采自于野外，不同地点和时间菇蕾的发育状态不一致，野外环境中诸多不确定的环境刺激也会导致菇蕾发育的差异。根据现代分子系统学的研究成果，大多数研究者认为鬼笔类真菌中菌裙的有无以及菌盖顶端是否穿孔，不能作为属这一级别的分类依据，竹荪属的种类应合并到鬼笔属中。高等真菌个体发育研究是系统学研究的重要组成部分，通过个体发育研究能够反映真菌内部可能的进化关系，对确定不同类型真菌的亲缘关系及探讨高等真菌内部可能的进化关系具有重要意义。国内外对高等真菌个体发育的研究起源于19世纪末，至今已有百余种被研究和描述，近年来的研究成果表明，石蜡切片法在对大型真菌进行制作切片并观察的过程中可以有效保护真菌内部组织，能够真实地还原真菌内部的发育过程，为大型真菌类群研究提供了参考依据。鬼笔类真菌是比较特殊的被果型子实体发育类型，子实体的发育过程是在密闭的菇蕾内部完成，从幼小菇蕾的形成到发育成熟需要经历很长时间，而子实体成熟破口伸出的过程则很短暂，在几个小时甚至几十分钟内即可完成。在对野生菌株进行驯化栽培的过程中，实验室稳定条件下形成的菇蕾受环境刺激的干扰较小，菇蕾的发育过程更能反映其真实的形态特点。本文借助石蜡切片法对驯化栽培出菇的超短裙竹荪P. ultraduplicatus、冬荪P. dongsun和红托竹荪P. rubrovolvatus不同发育阶段的菇蕾进行切片显微观察，揭示其子实体各器官的发育过程和形态特点，为鬼笔类真菌的分类研究和亲缘关系探索提供依据。供试菌株：超短裙竹荪采自山东省招远市罗山国家森林公园东北冲线路内三角顶附近背阴坡的落叶阔叶林下，经组织分离获得菌株；冬荪菌株采自山东省烟台市黄金顶附近落叶阔叶林的枯枝落叶层，经组织分离获得菌株；红托竹荪菌株引自贵州省织金县的1株栽培种。以上供试菌株由鲁东大学程显好教授和刘宇副教授进行鉴定，确定了3个菌株的真实性。栽培料配方：78%木屑、20%麦麸、1%石膏粉、1%蔗糖、料液比1∶1.2。将活化后的3个菌株接种于装有栽培料的原种瓶中，于25 ℃、黑暗条件下培养约60 d制成原种，再将原种接种于装有相同栽培料的菌袋内，于25 ℃、黑暗条件下培养70～80 d制成栽培菌袋。对菌棒直接覆土进行栽培出菇，在温度20～25 ℃、空气相对湿度80%～90%、微弱散射光条件下，将菌袋外皮脱去进行覆土栽培。栽培20～40 d后开始出现菇蕾，60～80 d后菇蕾发育完成，子实体开始成熟。在超净工作台内将盖玻片斜插于培养皿中PDA培养基的表面，然后将活化后的菌株接种于盖玻片的附近，接种后将培养皿置于25～28 ℃培养箱中进行培养，待菌丝生长并爬上盖玻片后取出，制成菌丝显微玻片，用生物电子显微镜（奥林巴斯BX61TRF）在100倍物镜下进行显微观察。在3个菌株栽培出菇的子实体成熟时，取菌盖表面成熟的子实层黏液，经稀释后制成孢子液显微玻片，在生物电子显微镜100倍物镜下进行显微观察。按照菇蕾直径5 mm（Ⅰ），10 mm（Ⅱ），15 mm（Ⅲ），20 mm（Ⅳ），30 mm（Ⅴ），40 mm（Ⅵ），分6个阶段对菇蕾进行采样，3个菌株的菇蕾切面如图1所示。 
图1 不同直径大小的菇蕾纵切面Fig. 1 Vertical section photos of button at different diameters自左至右菇蕾直径依次为5，10，15，20，30，40 mm Button diameter from left to right is 5, 10, 15, 20, 30, 40 mm, respectively 采样后用FAA固定液进行固定，石蜡切片的制作参照参考文献［14~15］中的实验方法进行，切片厚度为8～10 μm，采用结晶紫进行染色。制成玻片后在生物电子显微镜下进行观察和拍照。超短裙竹荪、冬荪和红托竹荪的菌丝均呈分支状，光滑、薄壁，有明显的锁状联合，红托竹荪的菌丝直径1.5～3.5 μm，形态饱满；超短裙竹荪的菌丝直径1.5～3.0 μm，形态较饱满；冬荪的菌丝最纤细，直径0.75～2.00 μm（图2）。
图2 鬼笔属3个种的菌丝形态Fig. 2 Morphological features of mycelia observed in three species of PhallusA. 超短裙竹荪P. ultraduplicatus；B. 冬荪P. dongsun；C. 红托竹荪P. rubrovolvatus 鬼笔属3个种的孢子均呈无色、光滑、透明的薄壁状，形状和大小具有差异（图3）。超短裙竹荪的孢子呈圆柱形，4.0～5.0×1.5～2.0 μm，Q=2.4；冬荪的孢子呈长椭圆形，3.8～4.5 ×1.8～2.3 μm，Q=1.9；红托竹荪的孢子呈长椭圆形，3.2～3.5×1.8～2.0 μm，Q=1.7。
图3 鬼笔属3个种的孢子形态Fig. 3 Morphological features of spores observed in three species of PhallusA. 超短裙竹荪P. ultraduplicatus；B. 冬荪P. dongsun；C. 红托竹荪P. rubrovolvatus 3个种子实体菌盖呈钟形（图4），顶部均有白色穿孔，菌盖表面的子实层呈墨绿色，冬荪菌盖表面的网格状突起间距较大，超短裙竹荪和红托竹荪的较小。3个种的菌柄呈白色的海绵状，超短裙竹荪和冬荪的菌托表面呈浅土黄色到灰白色、表面较光滑，红托竹荪的菌托呈浅棕红色、表面较粗糙。在菌柄与菌盖之间，超短裙竹荪的菌裙质地较薄，长约4 cm，带有不规则形状的网孔；红托竹荪的菌裙质地较厚，长约7 cm，带有圆形网孔，冬荪子实体表面未见菌裙。将冬荪子实体剖开（图4-D），发现其菌柄和菌盖之间的菌幕断裂为片状的薄膜。
图4 3个种的子实体Fig. 4 Fruit bodies of three species of PhallusA.超短裙竹荪P. ultraduplicatus；B.红托竹荪P. rubrovolvatus；C.冬荪P. dongsun；D. 冬荪子实体的纵切面The longitudinal section of P. dongsun 超短裙竹荪菇蕾的胶质腔在第Ⅰ阶段时开始形成（图5-Ⅰ），中心分生部位的菌丝比较疏松（图6-Ⅰ）。在第Ⅱ阶段，胶质腔进一步增大，连着胶质腔的子实层开始形成，菌盖和菌柄等器官未开始分化（图5-Ⅱ），菌盖和菌柄的分生部位菌丝开始变得紧密、未呈现交织状（图6-Ⅱ）；第Ⅲ阶段，子实层进一步发育，菌盖与菌柄之间开始出现比较模糊的分界，菌柄腔开始形成，菌柄内壁开始呈现组织块（图5-Ⅲ），菌柄顶端与菌盖连接处的菌丝开始出现交织状（图6-Ⅲ）。在第Ⅳ阶段，子实层开始出现孢子的轮廓，菌盖与菌柄的分化程度与第Ⅲ阶段无显著变化（图5-Ⅳ）；菌柄顶端与菌盖连接处的交织状菌丝的密度明显增大（图6-Ⅳ）。在第Ⅴ阶段，菌柄腔形成贯通的管状，顶部穿孔已经形成，子实层进一步成熟，呈现纹理状，菌柄和菌盖未完成分化（图5-Ⅴ），菌柄与菌盖连接处的菌丝开始变得疏松，变成孔隙较大的交织状（图6-Ⅴ）。在第Ⅵ阶段，菌盖和菌柄分化成各自的组织状，菌柄呈褶皱状，褶皱间孔隙比较明显，菌盖致密，内有分株状致密组织，菌柄顶端与菌盖连接处出现疏松的菌裙，菌裙组织在菌盖与菌柄间隙一直往下排列（图5-Ⅵ），菌柄与菌裙连接处的菌丝呈现组织状，孔隙较大，连接点菌丝密度较大（图6-Ⅵ）。
图5 超短裙竹荪的菇蕾发育过程Fig. 5 Button developmental process of P. ultraduplicatusa. 胶质腔Colloid cavity；b. 子实层Hymenium；c. 菌柄Stipe；d. 菌盖Pileus；e. 菌裙Indusium 
图6 超短裙竹荪菇蕾发育过程中的菌丝形态Fig. 6 Morphological features of mycelia observed during the button development of P. ultraduplicatusⅠ~Ⅵ为根据不同菇蕾直径划分的6个发育阶段 Ⅰ~Ⅵ show the six stages of button growth divided according to its different diameter 冬荪的菇蕾发育较快，子实体各部分在第Ⅳ阶段基本完成分化。在第Ⅰ阶段时，胶质腔开始形成，内部组织疏松，靠近菌盖与菌裙分生部位的组织较致密（图7-Ⅰ），中心的分生部位菌丝比较疏松，初步呈现交织状（图8-Ⅰ）。在第Ⅱ阶段，连着胶质腔的子实层及菌柄腔开始形成，菌盖和菌柄的连接部位出现模糊的分界（图7-Ⅱ），菌盖和菌柄的分生部位菌丝呈明显的交织状（图8-Ⅱ）；第Ⅲ阶段，子实层中形成分支状突出物连接在菌盖外侧，菌柄腔形成贯通的管状，菌柄顶部穿孔已经形成，菌柄和菌盖未出现明显的分化组织（图7-Ⅲ），菌盖与菌柄连接处交织状组织的形态与第Ⅱ阶段相比未发生明显的变化（图8-Ⅲ）。在第Ⅳ阶段，子实层、菌盖与菌柄基本发育完成，菌柄顶端内部呈现叠加的褶皱状（图7-Ⅳ），菌盖与菌柄之间发育出1层薄壁组织，该组织即为菌幕；菌柄与菌盖连接处的菌丝呈现各自的组织状，中间的胶质比较疏松，染色较明显（图8-Ⅳ）。第Ⅴ～Ⅵ阶段，菇蕾内部子实层、菌盖、菌柄变化不明显，菌盖变得更加致密，菌盖与菌柄之间菌幕的组织变得致密（图7-Ⅴ~Ⅵ），菌盖、菌柄和菌盖内膜的菌丝呈各自紧密的组织状（图8-Ⅴ~Ⅵ）。
图7 冬荪的菇蕾发育过程Fig. 7 Button developmental process of P. dongsuna. 胶质腔Colloid cavity；b. 子实层Hymenium；c. 菌柄Stipe；d. 菌盖Pileus；f. 菌幕Veil 
图8 冬荪菇蕾发育过程的菌丝形态Fig. 8 Morphological features of mycelia observed during the button development of P. dongsun红托竹荪的菇蕾发育过程与超短裙竹荪相似，分化速度稍快。在第Ⅰ阶段时，胶质腔开始形成（图9-Ⅰ），分生部位菌丝比较疏松（图10-Ⅰ）。在第Ⅱ阶段，胶质腔进一步增大，内部的胶质组织可能因含水量较高，制作切片的过程中经脱水与复水后出现裂缝，子实层开始形成，菌柄腔开始发育，菌盖和菌柄等部位未开始分化（图9-Ⅱ）；菌盖和菌柄的分生部位菌丝开始变得紧密、呈现交织状（图10-Ⅱ）；第Ⅲ阶段，子实层进一步发育，菌柄腔内部、菌盖与菌柄连接处呈现不连续的块状，菌柄发育组织较厚（图9-Ⅲ）；菌柄顶端与菌盖连接处的菌丝呈现更加紧密的交织状（图10-Ⅲ）。在第Ⅳ阶段，菌柄腔已经形成，菌盖与菌柄之间的连接处出现疏松的菌裙组织（图9-Ⅳ）；菌柄与菌盖连接处的交织状菌丝孔隙变大、密度变小（图10-Ⅳ）。在第Ⅴ阶段，菌柄顶部穿孔已经发育完成，菌柄组织肥厚、内外呈现块状表面，菌盖变得致密，菌柄与菌盖连接处有明显的疏松菌裙组织，子实层进一步成熟，呈颗粒状（图9-Ⅴ）；菌柄与菌盖连接处的菌丝较疏松，交织状不明显（图10-Ⅴ）。在第Ⅵ阶段，菌盖和菌柄分化成各自明显的组织状，菌柄呈较厚的褶皱状，菌盖致密，菌盖内表面有1层较稀薄的膜状组织，菌裙着生于菌柄顶端与菌盖的连接处，菌裙紧贴着菌柄，与菌盖内膜之间有1条明显的间隙（图9-Ⅵ）；菌柄与菌裙连接处的菌丝差异较明显，菌柄处的菌丝排列致密、呈规则的组织状，菌裙的菌丝呈疏松的交织状、孔隙较大（图10-Ⅵ）。
图9 红托竹荪的菇蕾发育过程Fig. 9 Button development process of P. rubrovolvatusa.胶质腔Colloid cavity；b.子实层Hymenium；c.菌柄Stipe；d.菌盖Pileus；e.菌裙Indusium 
图10 红托竹荪菇蕾发育过程的菌丝形态Fig. 10 Morphological features of mycelium observed during the button development of P. rubrovolvatus超短裙竹荪、冬荪和红托竹荪的菌丝都有明显的锁状联合，呈分支状，直径0.75～3.50 μm，红托竹荪的菌丝形态比较饱满、菌丝较粗，其次是超短裙竹荪，冬荪的菌丝相对比较纤细。在100倍物镜下，3个种的孢子均呈椭圆柱形，长3.0～5.0 μm，直径1.5～2.5 μm。与其他大多数鬼笔类真菌一样，孢子产生于菌盖表面的子实层黏液中，且密度很大，本文在制作孢子显微玻片时必须对孢子液进行数十倍的稀释后才能进行孢子的形态观察。子实层黏液特殊臭味用来吸引蝇虫的啃食进行孢子传播，以利于鬼笔类真菌繁殖，有研究者认为该类孢子经过蝇虫的消化系统后可能会有利于其自身萌发。冬荪的菌幕在菇蕾内发育时，组织比较疏松完整，而在子实体伸长成熟的过程中，菌幕迅速失水而变成破裂膜片状残留于菌盖与菌柄之间；超短裙竹荪由于菌裙比较纤细，在子实体伸出时也容易失水脱落。由于鬼笔类真菌子实体伸出的过程非常迅速，在此过程中菌幕和菌裙也容易失水而迅速萎缩破碎，该现象给野外采集时进行鉴定增加了困难。通过对菇蕾发育过程进行切片观察后发现，3个种的菇蕾内部发育顺序基本一致，各器官发育完成的时间不同，最先发育的都是胶质腔，接着是子实层、菌柄腔、菌盖、菌柄、菌裙（菌幕）。分生点位置的菌丝形态经历了从疏松到紧密、从交织状到组织化的变化过程。冬荪因为没有明显的菌裙结构而通常被人们称作“白鬼笔”，本文在对冬荪菇蕾进行切片观察时，发现其菌盖内侧靠近顶部穿孔与菌柄连接处发育出质地较薄的膜状组织。该膜状组织被认为是退化的菌裙组织，被很多研究者称为菌幕（Veil），本文的研究结果支持竹荪属不足以单独列为1个属且竹荪属所有种都应归到鬼笔属的观点。研究还发现冬荪的菇蕾发育成熟度相对较早，在第Ⅳ阶段，菇蕾内各器官基本已发育完成；超短裙竹荪的菇蕾发育最慢，在第Ⅵ阶段各器官才能发育完成。在前期的栽培出菇过程中，超短裙竹荪的菇蕾在发育到直径为5～8 cm才能破口而出，冬荪和红托竹荪的菇蕾在直径为4～6 cm时即可破口而出。李能章等［19］对采自野外的不同大小的冬荪菇蕾进行了从菇蕾阶段到成熟子实体阶段的个体发育研究，发现在无外源营养供给的情况下，只有直径在2 cm以上的菇蕾才能发育成熟，在有外源营养时，直径<2 cm的菇蕾会继续发育，最终也会发育成熟。在本研究中，冬荪菇蕾在发育到直径为2 cm的第Ⅳ阶段时，内部子实体各部位均已发育完成，具备了子实体成熟的条件，这与李能章等的研究结果一致。红托竹荪的菇蕾在直径3 cm时（第Ⅴ阶段）发育完成，超短裙竹荪在直径4 cm时（第Ⅵ阶段）才能发育完成，在栽培出菇实验中发现红托竹荪和超短裙竹荪的菇蕾必须达到与此相应的直径大小后才会开始成熟，而小于这个直径大小的菇蕾在受到不利的环境刺激时会出现枯萎败育的现象。鬼笔类真菌的菇蕾在发育到内部子实体各器官均分化成熟后才能破皮而出，而不同的营养和环境条件会影响菇蕾的形成时间和大小。引用本文： 李政，程显好，刘宇，等.鬼笔属3种真菌的个体发育及形态观察［J］.菌物研究，2024，22（2）：158-165. 作者简介：李政，男，在读硕士，主要研究方向为野生菌物资源驯化栽培。 通讯作者：王建瑞，E-mail：jianrui302@163.com 基金信息： 山东省现代农业产业技术体系食用菌产业体系（SDAIT-07-03），烟台市校地融合发展项目（2021XDRHXMPT09） 中图分类号： Q949.325 文章编号：1672-3538（2024）02-0158-08 文献标识码： A 收稿日期：2022-04-19 出版日期：2024-06-20 网刊发布日期：2024-04-25
|
