蛹虫草hat启动子的克隆及功能分析

东营菌物科学 2024-05-20 发布于山东

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张琳，梅生杰，王莉颖，程爽爽，李长田，李玉，赫荣琳

1. 食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308；3. 国家合成生物技术创新中心，天津 300308；4. 吉林农业大学菌物学院，长春 130118

摘要从蛹虫草中克隆出1个组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltransferase)基因的hat启动子，长度为1 509 bp，并对该启动子的序列进行详细分析。依据作用元件预测结果显示，hat启动子含有CAAT-box和TATA-box等典型的顺式作用元件，以及参与光响应的顺式作用元件G-box，参与水杨酸响应的顺式作用元件SARE等。将hat启动子连接于报告基因绿色荧光蛋白基因gfp (Green fluorescence gene)的上游，与gfp融合基因表达构建来鉴定启动子的活性。经过农杆菌转化，得到的疑似转化子进行PCR验证、gfp表达水平分析及荧光检测，结果表明：该启动子在蛹虫草菌丝中有较强的驱动GFP表达的能力，在荧光显微镜下可以观察到转化子具有强烈的绿色荧光。开展此研究为食用菌菌种改造提供启动子元件及建立高效的蛹虫草异源基因表达体系奠定基础。

关键词蛹虫草；hat启动子；绿色荧光蛋白；序列分析

蛹虫草Cordyceps militaris又名北冬虫夏草、北虫草等，隶属于子囊菌门Ascomycota，核菌纲Pyrenomycetes，球壳目Sphaeriales，麦角菌科Sordariomycetes，虫草属Cordyceps，是一种重要的食药用真菌。我国已经实现蛹虫草规模化人工栽培，有研究证实人工栽培的蛹虫草与野生蛹虫草在生物活性成分方面无明显差异。另一方面，蛹虫草的人工栽培需要适宜的温度、湿度及光照，生长周期相对较长，也限制了蛹虫草大规模利用。相对于子实体培养，菌丝体可以通过液体发酵等手段大量培养，培养条件要求相对简单。因此，采用菌丝体作为载体，利用基因工程手段实现目标产物过量表达，可以满足蛹虫草作为医疗保健品的要求，实现大规模生产。

国内外对于蛹虫草的研究大多集中在活性成分、栽培条件优化等方面，针对分子生物学方面的研究相对较少。2011年蛹虫草全基因组数据库已被公开发表，这为蛹虫草的分子生物学相关研究提供了一定的基础。在基因表达过程中，最重要的步骤是基因表达的第一阶段，即转录过程，转录的“开关”启动子决定转录的起始位点和基因表达的程度，找到能够高强度并稳定表达的强启动子尤为重要。目前在蛹虫草乃至食用菌基因工程技术发展中瓶颈问题之一即缺少高效的启动子元件。在基因的表达与调控过程中，启动子是重要的顺式作用元件。目前食用菌遗传转化体系中常用的启动子主要是ras和gpd 2个启动子，这2个启动子广泛用于香菇、灵芝、双孢菇等多种食用菌中。仅2个启动子不能满足食用菌同源/异源基因表达的需求。因此寻找稳定高效的强启动子尤为重要。

组蛋白的尾部参与染色质结构的变化并对基因表达具有重要作用。在核心组蛋白的氨基端尾部的保守赖氨酸残基的乙酰化和脱乙酰化与转录活性有关，组蛋白乙酰转移酶（HATs）将核心组蛋白乙酰化，从而导致染色质结构的变化和基因表达。同时乙酰化参与核小体组装过程中组蛋白的沉积、染色质纤维的高阶折叠、非组蛋白与组蛋白的相互作用以及细胞染色质的转录。HATs参与了核反应，包括转录、DNA复制和DNA 修复。组蛋白修饰通过组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase， HDAC））抑制基因表达和组蛋白乙酰转移酶（HAT）促进基因表达，在基因表达调控方面扮演着重要角色。组蛋白乙酰化通常与基因的转录激活有关，是一种重要的翻译后修饰方法。

本试验以蛹虫草为材料，对组蛋白乙酰转移酶hat启动子进行基因克隆，从蛹虫草中克隆得到1段1 509 bp的hat启动子序列并进行分析；以绿色荧光蛋白基因（Green fluorescence gene， gfp）作为报告基因对hat基因启动子进行活性评估。由此获得了以食用菌为来源的能够高效稳定地驱动异源基因表达的启动子。此研究提供的启动子元件可用于食用菌菌种的改造，同时为建立蛹虫草异源基因高效表达体系提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株及质粒

农杆菌Agrobacterium tumefaciens菌株为AGL1，大肠杆菌Escherichia coli菌株为DH5α，蛹虫草CM菌株由中国科学院天津工业生物技术研究所菌物反应器平台研究中心自行分离保存。载体pCAMBIA1300由菌物反应器平台研究中心保存。

1.1.2 主要试剂

抗生素类试剂kanamycin、ampicillin、hygromycin等，均购自北京索来宝生物科技有限公司，限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific公司，高保真Taq酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，T₄连接酶、First Strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo Fisher Scientific公司，用于TA克隆的pGEM-T载体连接试剂盒购自Promega公司，植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA胶回收试剂盒（DNA GEI Extraction Kit）以及质粒小量提取试剂盒（Plasmid Miniprep Kit）均购自Axygen公司，其他化学试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 PCR等分子生物学方法

DNA片段克隆均使用以下扩增体系：10 µL的PCR buffer，pfu Taq 1 µl，dNTP 1 µl（10 mmol/L），模板1 µL（100 ng基因组DNA或3 ng质粒DNA），0.4 µL上游/下游引物（100 µmol/L）。PCR反应条件为：98 ℃ 3 min，35个循环［98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15~60 s（根据片段长度确定，每1 kb延伸时间为30 s）］，72 ℃ 9 min。PCR产物胶回收后连接pGEM-T载体上送样测序。限制性内切酶酶切、片段与载体连接、DNA提取及RNA提取均按照试剂盒说明书上方法进行。

1.2.2 GFP表达载体的构建

根据蛹虫草基因组数据库（https：//mycocosm.jgi.doe.gov/Cormi1/Cormi1.home.html）设计hat基因启动子、gpd基因终止子的PCR引物。以蛹虫草基因组DNA为模板，扩增hat启动子（引物为PhatF/PhatR）以及gpd终止子（引物为TgpdF/TgpdR）片段；以pEGFP质粒为模板，扩增gfp基因（引物为gfpF/gfpR）片段，引物序列见表1。

表1 引物Table 1 Primers sequences used in this study

注：小写字母表示酶切位点

Note：Small letters indicate digestion sites of restriction enzyme

首先将hat基因启动子插入到pCAMBIA1300的EcoRⅠ和SacⅠ位点。鉴定正确的载体用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，与同样酶切过的gpd终止子连接；最后将gfp基因插入到Sac Ⅰ和BamH Ⅰ位点，即构建完成GFP表达载体，命名为pCAMBIA1300-pHAT。

1.2.3 农杆菌介导的蛹虫草转化

采用冻融法转化，即将pCAMBIA1300-pHAT载体转入到农杆菌AGL1中。在含有50 µg/mL卡那霉素的LB平板上挑选新鲜培养的农杆菌单菌落，接种于5 mL LB中（含卡那霉素），置于28 ℃、180 r/min过夜培养。次日将200~400 µL培养液转移到5 mL含200 μmol/L AS的诱导液体培养基AIM中，OD值约0.15，28 ℃培养5~6 h使OD₆₀₀达到0.5~0.6。将100 µL培养好的农杆菌AGL1菌液和100 µL稀释好的孢子悬液（浓度为10⁶ 个/mL）混合均匀，然后将混合液涂布于铺有硝酸纤维素膜（NC）的AIM平板上。23 ℃共培养72 h；将膜切至小片，分别铺在含有600 µg/mL潮霉素、400 µg/mL头孢霉素、60 µg/mL链霉素的选择性培养基PDA上。23 ℃培养至转化子出现。

1.2.4 转化子的筛选及鉴定

将在选择性培养基上长出的转化子挑取后，在含有600 µg/mL潮霉素的PDA平板上再次筛选。长出的转化子接于含有10 mL的PDB培养基的50 mL离心管中，28 ℃、200 r/min培养48 h，所得的菌丝提取基因组DNA作为模板进行PCR验证。gfp验证引物序列gfpcheckF/R详见表1。

1.2.5 转化子的荧光定量PCR分析及荧光检测

PCR验证正确的转化子再进行RNA提取，反转录进行荧光定量PCR验证gfp基因在mRNA水平上的表达情况。荧光定量PCR的反应体系及反应条件参照SYBR^® Premix Ex Taq^TM说明书（Takara）。

将GFP表达强度高的转化子接到PDA平板上，25 ℃黑暗培养10 d。牙签挑取转化子的菌丝于载玻片上，置于荧光显微镜下观察转化子是否有绿色荧光。

1.2.6 hat启动子序列分析

利用PlantCARE在线分析工具对hat启动子作用元件分析。

2 结果与分析

2.1 hat启动子的克隆及序列分析

以蛹虫草CM菌株的基因组DNA为模板，扩增hat启动子片段，电泳图结果显示，片段大小约为1.5 kb，与目的片段大小一致（图1）；将所得片段经过TA克隆连接到pGEM-T载体上，PCR验证正确后送样测序。经与蛹虫草基因组数据库比对，该启动子片段大小为1 509 bp，序列相似度100%。

图1 蛹虫草hat启动子的扩增Fig. 1 Amplification of hat promoter fragment from Cordyceps militaris

M. Marker（Biomed BM5000 DNA Marker）；Prohat. hat启动子hat promoter

通过PlantCARE数据库在线分析启动子区域的转录因子结合位点及作用元件分析，结果见表2。除了与启动子基本活性有关的核心启动子元件TATA-box、基本启动子区域CAAT-box，以及顺式作用元件A-box外，还含有大量的其他功能的启动子元件。其中，参与光调控的作用元件有2个，分别是G-box和Sp1。G-box需要特异的结合SP1（+510）才能促进基因的转录；而与诱导相关的顺式作用元件有甲基茉莉酸应答顺式作用元件CGTCA-motif（CGTCA）和TGACG-motif（TGACG），二者可能参与调节生长发育；同样具有生长调节有关的作用元件还有4个：ABRE，P-box，GARE-motif和TGA-element。ABRE顺式作用元件参与脱落酸的反应，位于-1015位点的P-box（CCTTTTG）和+1747位点的GARE-motif（TCTGTTG）参与赤霉素响应，而TGA-element（AACGAC）是与生长素有关的作用元件；SARE是与水杨酸反应的顺式作用元件；同时还有与环境胁迫有关的顺式作用元件LTR（CCGAAA），应答区域位于+299且与低温有着密切的联系。

表2 PlantCARE预测hat启动子作用元件Table 2 Prediction of cis⁃acting regulatory elements within the hat promoter region using PlantCARE

2.2 表达载体的构建

以蛹虫草基因组DNA为模板，分别扩增得到hat启动子以及gpd终止子，通过酶切连接，连接到EcoRⅠ和SacⅠ位点以及BamHⅠ和HindⅢ位点。再以pEGFP质粒为模板，扩增gfp基因插入到SacⅠ和BamHⅠ位点，完成载体构建并将该载体命名为pCAMBIA1300-pHAT（图2）。

图2 hat启动子载体构建示意图Fig. 2 Illustration of hat promoter vector structure

2.3 蛹虫草的农杆菌转化及转化子PCR鉴定

将再次筛选的转化子提取基因组DNA进行PCR验证。如图3所示，随机挑取7个转化子通过PCR扩增得到条带大小约250 bp的条带，说明gfp基因已经成功插入到该转化子的基因组中（2，3，4，5，7号），没有得到目的条带的转化子（1，6号）表明gfp基因并未插入到基因组中。

图3 转化子PCR验证Fig. 3 PCR confirmation of transformants

M. Marker（Biomed BM5000 DNA Marker）; 1~7. 转化子 Transformants

2.4 转化子gfp基因mRNA表达水平分析及转化子荧光检测

将上述PCR验证阳性的转化子随机挑取3个、未转化蛹虫草菌株以及gfp表达阳性菌株作为对照接种于液体培养基培养，48 h后收集菌丝并提取总RNA。RNA反转录成cDNA后进行荧光定量PCR检测gfp在mRNA水平上的表达情况。由图4可知，在未转化菌株中检测不到gfp的表达，3个转化子中均检测到gfp的表达，其中3号转化子表达量最高，是2号转化子的1.79倍和7号转化子的2.4倍。挑取3号转化子的菌丝置于荧光显微镜下观察荧光，如图5所示，3号转化子的菌丝发出强烈的绿色荧光。上述结果说明，hat启动子在蛹虫草体内可以驱动外源gfp基因的表达，并可以表达出具有强烈荧光的绿色荧光蛋白。

图4 gfp基因表达水平分析Fig. 4 Relative expression activity of gfp gene

CM. 蛹虫草对照菌株（未转化蛹虫草菌株） Control strain of Cordyceps militaris (untransformed Cordyceps militaris); T2, T3，T7. PCR验证得到的阳性转化子 Positive transformants verified by PCR

图 5 T3转化子荧光检测Fig. 5 Fluorescence microscopy detection of T3 transformant

A. T3转化子的明场图像Bright-field image of T3 transformant; B. T3转化子的荧光图像Fluorescence image of T3 transformant

3 讨论

启动子是基因的重要组成部分，被RNA聚合酶识别并结合，控制基因的转录，是目的基因在转录水平上重要的调控元件。真菌的转基因多为整合表达，整合表达中的基因表达水平与启动子的驱动能力密切相关，目前在蛹虫草中最常用的启动子是gpd启动子，通过该启动子已经成功实现了一些蛋白如抗菌肽的异源表达，但仅此1个启动子，远远不能满足异源表达的需求。

本研究从蛹虫草中克隆获得1段长度为1 509 bp的hat启动子序列，通过分析发现，该启动子序列中含有典型的启动子顺式作用元件CAAT-box、TATA-box等。CAAT-box能够控制转录的起始频率并且是启动子行使功能的重要元件之一，在该菌株的hat启动子上共有14个CAAT-box，正链负链平均分布。该基因上共有7个 TATA-box，且均在负链上。其中TATA-box对基因转录具有关键作用，TATA框与RNA聚合酶结合后才能开始转录。通过PlantCARE预测，其他的重要作用元件G-box、A-box、P-box等，不仅有与光调控有关，同时调节生长发育、与生长调节有关，并且部分元件还与水杨酸、低温等胁迫有关。构建该启动子绿色荧光蛋白的表达载体并转入蛹虫草中发现，该启动子可以驱动绿色荧光蛋白强烈表达。因此通过本研究，获得了高效的驱动异源基因表达的启动子，丰富了蛹虫草中启动子元件。另一方面，在基因功能的研究中，基因的时空表达模式以及蛋白的细胞内定位是一个重要的方法。通常使用目的基因自身的启动子来启动目的荧光蛋白融合表达，但有时自身启动子的启动能力较弱而不能产生足够强度的荧光供观察。本研究中的hat启动子具有较强的启动能力，在蛹虫草功能基因分析涉及蛋白定位等也可以利用该启动子实现。