【原】【论 著】微小RNA-145调控EPS15介导的细胞自噬参与心房颤动发生的机制

作       者：王超，姜晨阳，俞虹宇，王如兴，钟国强

作者单位：南京医科大学附属无锡人民医院心内科（王超，王如兴）；广西医科大学附属第一医院心内科（姜晨阳，俞虹宇，钟国强）

作者简介：王超，主要从事心电生理的临床和基础研究。

通信作者：钟国强，E-mail: [e-mail]

基金项目：国家自然科学基金资助项目（82370342）；江苏省自然科学基金资助项目（BK20231145）

摘  要

目的  探讨微小RNA(microRNA,miRNA)-145调控表皮生长因子受体底物15(epidermal growth factor receptor pathway substrate 15,EPS15)介导的细胞自噬参与心房颤动（简称房颤）发生的机制，寻找房颤发生过程中潜在的生物标志物，为房颤的预防和治疗提供新思路。方法  收集58例风湿性心脏病换瓣手术患者的右心耳组织，将这些患者分为窦性心律组（16例）和房颤组（42例）。通过尾静脉注射Ach-CaCl₂混合溶液构建大鼠房颤模型，注射生理盐水作为窦性心律组。检测两组患者右心耳组织及两组大鼠心房中miRNA-145的表达水平，及其EPS15、Cx43、LC3、p62的RNA和蛋白表达水平。构建体外自噬模型，探讨miRNA-145靶向调控EPS15介导的细胞自噬参与房颤发生的机制。结果  窦律组患者右心耳及窦律组大鼠心房miRNA-145、Cx43的RNA及蛋白相对表达量分别高于房颤组患者及房颤组大鼠（均P<0.05），而EPS15的RNA及蛋白相对表达量分别低于房颤组患者及房颤组大鼠（均P<0.05）。体外实验结果显示，miRNA-145能够通过EPS15调控H9c2细胞的自噬程度（P<0.05）。结论  miRNA-145可通过调控EPS15介导的细胞自噬参与房颤的发生，表现为miRNA-145显著下调、EPS15上调、自噬增强和Cx43降解。

关键词

心房颤动；微小RNA-145；自噬；Cx43；EPS15；p62；LC3

引用格式

王超,姜晨阳,俞虹宇,等. 微小RNA-145调控EPS15介导的细胞自噬参与心房颤动发生的机制［J］. 实用心电与临床诊疗, 2025, 34(1): 29-35.

DOI: 10.13308/j.issn.2097-5716.2025.01.007

      心房颤动（简称房颤）是临床上最常见的持续性心律失常之一，严重危害人类健康，除了患病率较高以外，还可引起脑卒中和心力衰竭等严重并发症。房颤作为一种多因素疾病，一般在有潜在心脏异常的情况下发生，并受到电活动和结构改变的支持，通常称为心房重构。近年来，微小RNA(microRNA,miRNA)在房颤中的调控作用成为研究热点，研究表明，miRNA与心房电/结构重构和自主神经重构密切相关，一些研究提出miRNA可作为诊断房颤的有效生物标志物。自噬是Cx43降解的重要方式，自噬激活可明显减少心房Cx43的表达。表皮生长因子受体底物15（epidermal growth factor receptor pathway substrate 15,EPS15）在Cx43重构和自噬降解的过程中起着重要作用。自噬过度激活导致的心房Cx43重构，可能是自噬异常参与房颤发生的机制之一。利用生物信息学技术，本课题组发现EPS15是miRNA-145潜在的靶基因，已有研究证实，房颤患者心房组织中miRNA-145的表达明显下调。据此，本研究提出如下假设：通过调控EPS15介导的细胞自噬激活，减少细胞Cx43的表达，促进细胞的异常电传导及房颤的发生发展，进而探索房颤发生的机制，寻找潜在的治疗靶点。

  1  资料与方法

1.1  研究对象

      选取2019年9月至2020年6月广西医科大学第一附属医院心胸外科收集的58例风湿性心脏病（简称风心病）换瓣手术患者的右心耳组织作为检测标本。所有病例已排除以下情况：① 严重心功能不全（NYHA心功能Ⅳ级）；② 全身炎症反应性疾病，包括严重的全身性感染、感染性心内膜炎；③ 风湿性活动、自身免疫性疾病；④ 合并有肺源性心脏病；⑤ 肝、肾等重要器官严重功能不全；⑥ 甲状腺功能亢进等代谢紊乱性疾病；⑦ 有过量酒精摄入；⑧ 恶性肿瘤。所有患者均签署知情同意书，且本研究已获广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准。所有患者入院后均完善血常规、血糖等术前检查，心功能NYHA分级均在Ⅰ—Ⅲ级。根据动态心电图及心电图诊断结果，将入选患者分为窦性心律（简称窦律）组（16例）和房颤组（42例）。

      选用20只平均体重（200±30） g的健康标准清洁级SD雄性大鼠，分为房颤组和窦律组，各10只。房颤组：经尾静脉注射Ach（66 mg/kg）-CaCl₂（10 mg/kg）混合溶液，每日固定时间给药1次，重复2周。窦律组：在同样条件下，用生理盐水代替Ach-CaCl₂混合溶液。记录Ⅱ导联心电图，以p波消失、f波出现和RR间期不等作为房颤发作的标志，以f波消失和p波出现作为恢复窦律的标志。

      使用HBLV-mcherry-EGFP-LC3-PURO慢病毒（中国汉恒公司）感染正常H9c2细胞，建立H9c2自噬细胞系，分为空白对照组、miR-145模拟物组、miR-145模拟物干预组、miR-145抑制剂组、miR-145抑制剂干预组，每组各3例。再按照分组使用与Lipofectamine 3000相对应的细胞转染miRNA-145模拟物和miRNA-145抑制剂，转染后放进培养箱孵育48 h，以自噬诱导剂西罗莫司(1 000 nmol/L)干预相对应组的细胞，诱导细胞自噬8 h。

1.2  采集标本

      ① 风心病换瓣手术患者的右心耳组织;② 大鼠心房组织；③ H9c2细胞。

1.3  RNA的提取和测定

      随机选取房颤组、窦律组患者各10例，以及房颤组、窦律组大鼠各7只，利用逆转录定量聚合酶链反应技术，分别检测两组患者右心耳和两组大鼠右心房组织中miRNA-145、EPS15、Cx43的相对表达量。

1.4  蛋白的提取和测定

      随机选取房颤组、窦律组患者各6例，以及房颤组、窦律组大鼠各8只，利用蛋白免疫印迹实验，分别检测两组患者右心耳和两组大鼠右心房组织中EPS15、Cx43、p62、LC3蛋白的相对表达量。

1.5  统计学方法

      利用SPSS 17.0软件对数据进行处理，计数资料以n(%)表示，两组间比较采用χ²检验。符合正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较用独立样本t检验；否则以中位数（四分位数）描述，组间比较采用Mann-Whitney检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  窦律和房颤组患者的基线资料比较

      窦律组和房颤组患者在年龄、性别、基础心脏疾病等基线临床资料方面比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

2.2  窦律和房颤组患者右心耳miRNA-145、Cx43、EPS15表达水平比较

      窦律组患者右心耳miRNA-145相对表达量高于房颤组患者［（4.678 0±0.224 3） vs. （1.001 0±0.035 7），P＜0.05］。窦律组患者右心耳Cx43的RNA相对表达量高于房颤组［（1.151 0±0.359 6） vs. （0.842 0±0.041 8），P＜0.05］；窦律组患者右心耳EPS15的RNA相对表达量低于房颤组［（1.001 0±0.034 4） vs. （2.379 0±0.486 1），P＜0.05］。

2.3  房颤和窦律组患者右心耳蛋白表达水平比较

      房颤组患者右心耳EPS15蛋白相对表达量高于窦律组患者［（0.536 3±0.062 5） vs. （0.351 4±0.017 8），P<0.05］，而Cx43蛋白相对表达量低于窦律组患者［（0.271 7±0.016 1） vs. （0.571 6±0.047 2），P<0.05］。房颤组患者右心耳p62蛋白相对表达量高于窦律组患者［（0.574 1±0.075 4） vs. （0.273 8±0.036 6），P<0.05］，而LC3蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值高于窦律组患者［（1.289 0±0.016 0） vs. （0.499 9±0.022 7），P<0.05］。见图1。

2.4  房颤大鼠造模

      经Ach（66 mg/kg）-CaCl₂（10 mg/kg）混合溶液注射2周后的大鼠均诱发房颤，而对照组大鼠均未出现房颤。房颤组和窦律组大鼠的心电图见图2。

2.5  房颤组及窦律组大鼠心房miRNA-145、EPS15、Cx43的RNA表达量

      窦律组大鼠心房miRNA-145相对表达量高于房颤组大鼠［（1.010 0±0.136 9） vs. （0.507 0±0.100 6），P＜0.05］。窦律组大鼠心房EPS15的RNA相对表达量低于房颤组大鼠［（1.060 0±0.332 9） vs. （2.025 0±0.112 8），P＜0.05］。窦律组大鼠心房Cx43的RNA相对表达量高于房颤组大鼠［（1.007 0±0.258 3） vs. （0.458 2±0.167 3），P＜0.05］。

2.6  房颤组及窦律组大鼠心房蛋白表达量

      房颤组大鼠心房内EPS15蛋白相对表达量高于窦律组大鼠[(0.536 3±0.059 0) vs. (0.351 4±0.016 5)，P<0.05]，而Cx43蛋白相对表达量低于窦律组大鼠[(0.274 4±0.012 2) vs. (0.579 3±0.036 2)，P<0.05]。房颤组大鼠心房内p62蛋白相对表达量高于窦律组大鼠[(0.555 2±0.049 8) vs. (0.265 3±0.025 0)，P<0.05]，而LC3蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值高于窦律组大鼠[(1.375 0±0.035 2) vs. (0.953 8±0.045 1)，P<0.05]。见图3。

2.7  H9c2自噬细胞株的建立

      H9c2经HBLV-mcherry-EGFP-LC3-PURO慢病毒感染72 h，荧光倒置显微镜观察感染效果。本实验转染效率均在70%~90%。见图4。

2.8  H9c2细胞中EPS15、Cx43及自噬相关蛋白的表达

      分别检测空白对照组、miR-145模拟物组、miR-145模拟物干预组、miR-145抑制剂组、miR-145抑制剂干预组中LC3、p62、EPS15、Cx43的表达量。

      1） 空白对照组LC3蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值高于miR-145模拟物组［（1.061 7±0.046 8） vs. （0.759 7±0.102 7），P＜0.05］。miR-145模拟物组LC3蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值（0.759 7±0.102 7）低于miR-145抑制剂组（1.137 9±0.090 7），也低于miR-145模拟物干预组（0.930 2±0.138 1），且差异均有统计学意义（均P<0.05）。miR-145抑制剂组LC3蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值低于miR-145抑制剂干预组［（1.137 9±0.090 7） vs. （1.257 6±0.063 3），P<0.05］；其余各组之间差异无统计学意义。

      2） 空白对照组p62蛋白相对表达量高于其余各组（P<0.05），其余各组之间差异无统计学意义。

      3） 空白对照组EPS15蛋白相对表达量（0.203 5±0.013 5）高于miR-145模拟物组（0.103 1±0.018 6），也高于miR-145模拟物干预组（0.189 7±0.011 4），且差异均有统计学意义（均P<0.05）。miR-145模拟物组EPS15蛋白相对表达量（0.103 1±0.018 6）低于miR-145模拟物干预组（0.189 7±0.011 4），也低于miR-145抑制剂组（0.226 5±0.017 5），且差异均有统计学意义（均P<0.05）；其余各组之间差异无统计学意义或实验意义。

      4） 空白对照组Cx43蛋白相对表达量（0.617 4±0.035 5）低于miR-145模拟物组（0.820 5±0.055 5），高于miR-145抑制剂组（0.328 8±0.023 4），且差异均有统计学意义（均P<0.01）。miR-145模拟物组Cx43蛋白相对表达量（0.820 5±0.055 5）高于miR-145抑制剂组（0.328 8±0.023 4），且差异有统计学意义（P<0.01）。miR-145抑制剂组Cx43蛋白相对表达量高于miR-145抑制剂干预组［（0.328 8±0.023 4） vs. (0.212 6±0.022 4），P<0.05］；其余组间差异无统计学意义或实验意义。见图5。

3  讨论

      房颤作为一种多因素疾病，一般在有潜在心脏异常的情况下发生，伴随着电生理和结构改变，这种病理改变通常被称为心房重构。过去十年间，相关研究证实了miRNA在心血管疾病等多种人类疾病中的作用。miRNA不仅对心肌细胞的传导有直接和（或）间接作用，而且还能调节离子通道，间接影响心脏兴奋性。本研究结果显示，房颤患者右心耳中miRNA-145的相对表达量较窦律患者显著下调，表明miRNA-145下调通过参与心房结构重构和（或）电重构，促进房颤的发生与发展。

      本研究发现，房颤患者或房颤模型大鼠心房LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相对表达量明显增加。LC3Ⅱ是哺乳动物的自噬体标志物，目前被广泛用于监测细胞的自噬进程，表明房颤患者或房颤模型大鼠心房存在自噬的过度激活，导致心肌蛋白质稳态脱轨，从而可能引起以心房重构为特征的心脏受损，促进房颤的发生。除LC3蛋白以外，本研究中还对窦律、房颤患者和窦律、房颤大鼠模型心房中的p62蛋白进行了检测。p62蛋白在窦律患者右心耳中的相对表达量低于房颤患者。p62是自噬标志物之一，其本身也是一种应激蛋白，实际检测中会出现p62表达与自噬活性相反的情况。由于自噬是一个复杂的过程，因此不能完全依靠p62判定细胞自噬活性。本研究中房颤患者右心耳和大鼠心房中的Cx43与EPS15的相对表达量呈相反趋势，结合上述心房细胞的自噬激活，认为Cx43、EPS15与心房细胞自噬有着密切的联系。

      本研究利用miR-145模拟物/抑制剂转染H9c2自噬细胞株，探讨miRNA-145调控EPS15介导的细胞自噬参与心房Cx43重构的机制。相比于空白对照组，miR-145模拟物组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相对表达量显著降低，提示miR-145的过表达能够有效抑制自噬。尽管空白对照组与miR-145抑制剂组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相对表达量之间差异无统计学意义，但miR-145模拟物组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相对表达量显著低于miR-145抑制剂组。另外，miR-145模拟物组和miR-145抑制剂组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相对表达量低于其各自的干预组，表明miR-145能够有效地调控H9c2细胞的自噬程度。在本研究中，空白对照组自噬相关p62蛋白的相对表达量高于其余各组，但其余各组之间差异无统计学意义。空白对照组EPS15的相对表达量高于miR-145模拟物组，与miR-145抑制剂组却无显著差异，但其在miR-145模拟物组的相对表达量低于miR-145抑制剂组。上述结果提示高水平miR-145能够有效地抑制EPS15的表达，从而抑制细胞自噬。空白对照组与miR-145抑制剂组的EPS15相对表达量差异无统计学意义，可能是由于自噬细胞株的自噬激活，EPS15已处于高表达状态。由图5可发现，Cx43蛋白的相对表达量在miR-145模拟物组和miR-145模拟物干预组中均高于空白对照组，表明miR-145过表达会引起Cx43表达升高，同时miR-145抑制剂组和miR-145抑制剂干预组Cx43的相对表达量低于空白对照组、miR-145模拟物组、miR-145模拟物干预组。上述结果同样证明了miR-145的低表达也会引起Cx43表达下降。而通过miR-145模拟物干预组、miR-145抑制剂组与其各自的干预组进行对比，本研究发现自噬能够直接作用于Cx43，降低其表达。

      本研究通过观察房颤患者和动物模型心房miRNA-145、EPS15、Cx43、LC3和p62的表达情况，再以HBLV-mcherry-EGFP-LC3-PURO慢病毒构建H9c2细胞自噬模型，模拟心肌细胞自噬，并用miRNA-145转染细胞影响其表达，以西罗莫司进行干预，探究miRNA-145的差异化表达对心肌Cx43自噬程度的影响，以揭示miRNA-145在房颤的发生和发展过程中的调控机制。本研究主要得出以下结论：一是心房miRNA-145的表达下降与房颤的发生有关；二是EPS15的过表达引起自噬激活，导致心房Cx43的自噬降解；三是miRNA-145通过上调EPS15使细胞自噬激活并导致心房Cx43降解，可能是房颤发生的重要机制，也是房颤潜在的治疗靶点。

      本研究存在一定的局限性。首先，临床样本量较小，还需更多样本证实本研究结论。其次，临床上只能获得风心病换瓣手术患者的右心耳组织，故无法证明在非瓣膜性房颤患者中也能得出本研究结果。另外，由于无法构建房颤体外模型，仅能通过自噬模型来证明自噬能够直接降低Cx43的表达，因此无法完全模拟房颤患者的生理过程和物质代谢。最后，本研究仅讨论了miRNA-145调控下的细胞自噬，今后还需进一步进行生物信息学分析或全基因测序，以明确更多不同类型的miRNA对Cx43的调控机制。

    排版：李政萍

    统筹：顾   艳

    审核：徐云峰