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具体来看下步骤： 第一步，先对RNA进行特异性富集和打断。即在打断之前，我们需要搞清楚研究对象只是mRNA还是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠进行富集后再进行打断。如果是lncRNA和mRNA都要研究，则需要先用试剂盒将total RNA的rRNA先去除干净，再进行打断。如果是进行高通量测序打断长度约为100nt左右，而qPCR 则需要长度至少在200nt以上，部分论文甚至打断长度在300-500nt左右。一般根据文献中的资料显示，IP下来的片段用引物扩增出来的长度在130-150左右，所以100nt不到的长度要设计出合适的引物会非常困难。除非是用5’RACE扩增，否则还是建议大于200nt。 第二步，对打断完了的RNA片段进行抗体孵育和特异性富集。打断完了RNA我们会得到长度约为200-300的RNA片段。这时候我们可以分出约占m6A-IP部分RNA只有10%的RNA作为input。简单来说用于m6A IP的RNA有2ug，那么input的RNA需要在200ng左右。IgG富集的RNA起始量与m6A-IP的量一样，比例为1:1即2ug。 第三步，洗脱和逆转录扩增。接下来我们需要对m6A抗体和IgG抗体上洗脱下来的RNA，以及input的RNA，按照常规试剂盒要求进行洗脱，并用随机引物进行逆转录。
第四步，设计m6A-IP–qPCR 的特异性引物。由于m6A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现，那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长度会在130-150bp左右。这里需要注意的是，IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录，而第四步中设计的引物用的是特异性引物，这个大家要注意区分和甄别。 第五步，使用上一步设计好的引物，对input、m6A-IP和IgG-IP中的RNA进行qPCR反应并计算相应的CT值。 以到这里我们的实验部分已经完成了，简单总结下就是想要做够10个左右基因的验证，必须至少提供>200ug的total RNA以上。富集的RNA类型根据自己要求出发，如polyA RNA或rRNA-depleted RNA等，最后就是打断成200-300nt左右的长度。用于qPCR的RNA一共分成3类，即input、m6A-IP和IgG-IP，其中input占m6A-IP起始量约10%。如果用数字来表示那就是input需要100ng，m6A在IP前需要1ug，IgG在IP前也需要1ug。 |
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