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在做完m6A测序后，如何对差异甲基化的基因进行验证。简单来说就是IP后如何进行qPCR 实验。我们遇到的第一个疑问就是究竟能用多少RNA来做后期验证呢？换句话说，假如要验证10个基因，究竟需要多少total RNA或polyA的RNA才合适呢？ 我们先进行一个简单的计算，常规的RT-qPCR 1个反应（1个复孔）需要的total RNA至少0.1-1ug左右。我们按照最小反应起始量来算的话，那么1个反应需要至少100ng的total RNA，3个技术重复（3个复孔），总计total RNA为300ng。 我们知道total RNA中绝大部分为rRNA，那么只有不到5%的RNA为我们需要研究的对象。PCR反应需要引物跟目标序列区域进行充分碰撞，那么如果只使用mRNA会大大降低一次PCR反应的起始量。通过计算我们认为5-10ng做1次PCR反应较为合理。也就是1个样本中验证1个基因不做生物学重复只做3个复孔需要至少15ng的mRNA或300ng的total RNA。那么3个生物学重复就需要9个反应，总计45-90ng mRNA或900ng的total RNA。 根据上面的推算，IP下来的RNA若有500ng，可以验证6-12个基因左右（1个基因3个生物学重复，每个重复3个复孔即技术重复，所以一个基因总计9次反应）。哺乳动物IP效率在10-20%左右，植物在20-40%左右（最高可达50%）。那么假设要验证6-10个基因，哺乳动物需要至少2.5-5ug的mRNA和100-200ug的total RNA，植物样本至少需要1.25-2.5ug的mRNA和50-100ug的total RNA。若加入IgG抗体这个步骤，则需要对total RNA的起始量再次翻倍。 |
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