大跳蚤的背上有小跳蚤,而小跳蚤的背上又有更小的跳蚤,以至无穷。
——Augustus De Morgan
病毒只能在活细胞内增殖,或专性活细胞内寄生。
获得诺贝尔奖的病毒方面的研究:
1954年 在组织培养中培养脊髓灰质炎病毒。
1966年 癌病毒的发现
1969年 发现病毒和细胞的病毒感染
1975年 发现RNA肿瘤病毒依赖于RNA的DNA合成;DNA肿瘤病毒的繁殖
1976年 乙型肝炎病毒起源和传播的机理、慢病感染研究
1997年 朊病毒的发现
第一节 病毒
病毒:是一类由核酸和蛋白质等少数几种组分组成的超显微“非细胞生物”,本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子。
能以感染态和非感染态两种状态存在。
病毒的化学组成:由蛋白质和核酸组成,有的病毒还含有类脂质和多糖。
▲每种病毒只含一种核酸(遗传物质),要么是RNA,要么是DNA。大多数是RNA,少数是DNA;噬菌体例外(大多数是DNA)。
▲ 病毒的主要特征:
(1)形体极其微小(10~300nm),必须在电镜下才能观察,一般都能通过细菌过滤器。
(2)没有细胞构造,主要成分仅为核酸和蛋白质两种,故也称“分子生物”、“非细胞生物”。
(3)每一种病毒只含一种核酸,不是DNA就是RNA。
(4)既无产能酶系也无蛋白质合成酶系,只能利用宿主代谢系统合成自身的核酸和蛋白质。
(5)以蛋白质和核酸等元件的装配实现其大量繁殖。
(6)在离体条件下,能以无生命的化学大分子状态存在,并长期保存其侵染能力。
(7)对一般抗生素不敏感,但对干扰素敏感。
(8)病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中,诱发潜伏性感染。
一、病毒的形态构造和化学成分
(一)病毒的大小
个体微小,能通过细菌过滤器,必须用电子显微镜才能观察到,以nm为测量单位。病毒、细菌和真菌这三类微生物个体直径比大约为1:10:100。
标本 |
大致的直径或 其宽度×长度(nm) |
颤蓝细菌红细胞 |
7000 |
大肠杆菌 |
1300 ×4000 |
立克次氏体 |
475 |
痘病毒 |
230 ×320 |
流感病毒 |
85 |
T2大肠杆菌噬菌体 |
65 ×95 |
烟草花叶病毒 |
15 ×300 |
骨髓灰质炎病毒 |
27 |
(二)病毒的形态
1、典型病毒粒的构造
球状:球状病毒(或多面体病毒)。动物病毒多为球状。
杆状:杆状病毒(包括棒状或线状)。植物病毒多呈杆状。
蝌蚪状:蝌蚪状病毒。细菌病毒多呈蝌蚪状。
由于病毒是一类非细胞生物,所以病毒个体不能称作“单细胞”,而用病毒粒(或病毒颗粒)或病毒体表示。
▲ 病毒粒(或称病毒颗粒)专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。
病毒粒的主要成分:核酸和蛋白质。
l 核酸位于病毒粒的中心,构成了它的核心或基因组;
l 蛋白质包围在核心周围,形成衣壳,对核酸有保护作用。
l 核心和衣壳合称核衣壳,它是任何真病毒都具有的基本结构。
2、病毒粒的对称体制
病毒粒的对称体制只有两种:螺旋对称和二十面体对称(等轴对称)。
螺旋对称:能使核酸与蛋白亚基间的接触更紧密;
二十面体对称:有利于核酸以高度卷曲的形式包裹在衣壳中。
复合对称:
3、病毒的群体形态
当大量病毒粒子聚集在一起并使宿主细胞发生病变时,就可观察到群体形态。 如动物、植物细胞中的病毒包涵体、噬菌体的噬菌斑、植物叶片上的枯斑。
(1)包涵体
分布:细胞质或细胞核内,或细胞质、细胞核中都存在。
应用:① 病毒诊断;② 用于生物防治。
(2)噬菌斑
噬菌体侵染细菌细胞,导致寄主细胞溶解死亡,因而在琼脂培养基表面形成的空斑(“负菌落”)。
Ø 每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。
Ø 噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。
病毒的生长并不总是造成细胞裂解形成噬菌斑,尤其是动物病毒还可引起宿主细胞和组织微观或者宏观的变化和异常,称为致细胞病变效应。
病毒还能以透射电子显微镜直接计数。
(3)空斑和病斑
在动物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑,称为病斑。
(4)枯斑
植物叶片上的植物病毒群体。
大豆叶上枯斑 花生叶上枯斑
(三)三类典型形态的病毒及其代表
1、螺旋对称的代表——烟草花叶病毒(TMV)
TMV是发现最早、研究最深和了解最清楚的一种病毒。衣壳粒和核酸呈螺旋对称形排列,其外形呈直杆状。
2、二十面体对称的代表——腺病毒
一种动物病毒,其宿主包括人和各种动物。 没有包膜,有12个角,20个面,30条棱。外形呈球形。腺病毒核心是线状双链DNA(dsDNA),其基因组的大小约为36500个核苷酸对。
3、复合对称的代表——T偶数噬菌体
细菌病毒又称噬菌体(phage)(p68),是侵染细菌的病毒。它们是专性细胞内寄生物,可以噬菌体颗粒在细菌细胞外存在,但只能在细胞内繁殖。
噬菌体具有侵染细菌的能力,而且在细胞内指令合成噬菌体的成分。
大肠杆菌的T偶数噬菌体共有三种,即T2、T4和T6。它们在自然界分布极广,是分子生物学研究中的极好材料。
T4由头部、颈部和尾部三部分构成。由于头部呈二十面体对称,尾部呈螺旋对称,所以T4是一种复合对称结构。
T偶数噬菌体虽呈蝌蚪状,但吸附却是通过尾丝。尾丝吸附后,会使基板受到构型的刺激,接着尾鞘蛋白发生收缩,使尾管插入宿主细胞。尾管中空 是头部核酸注入宿主细胞的通道。
刺突:6个,具吸附功能;
尾丝:6根,由蛋白构成,折成等长的两段,具吸附专一性。
噬菌体由核酸基因组和四周称为衣壳的蛋白质外壳包围而构成,衣壳蛋白具有保护遗传物质和帮助侵染新的宿主的作用。外壳是由结构蛋白亚单位所组成,给噬菌体以特别明显的形状。
(四)病毒的化学组成
1、病毒的核酸
核酸构成病毒的基因组。病毒基因组在大小、结构和核苷酸的组成上是多种多样的,有RNA、DNA、线状、环状、闭环、缺口环、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、双链RNA(dsRNA)、单链RNA (ssRNA)、分段或者不分段的。
动物病毒以线状的dsDNA和ssRNA居多;
植物病毒以ssRNA居多;
噬菌体以线状的dsDNA居多。
病毒的基因组携带有作为病毒遗传密码的核酸序列。在被感染的细胞中,基因组被转录和翻译成氨基酸序列,并组成了病毒的结构蛋白和非结构蛋白。
2、病毒的蛋白
结构蛋白:是核衣壳、基质,或者是包膜中的蛋白。这些蛋白对病毒基因组起保护作用。
非结构蛋白:包含在病毒体内的非结构蛋白,通常具有酶的活性,对启动病毒的感染是必要的。
病毒蛋白,无论是结构蛋白(衣壳、包膜)还是非结构蛋白都是由病毒的基因组编码的。
3、脂类和糖类
脂类:一些磷脂、胆固醇和中性脂肪,多数存在于包膜。
糖类:主要是葡萄糖、龙胆二糖、岩藻糖、半乳糖等。
4、病毒的包含体
有的病毒在寄主细胞内形成包含体结构,它们多数位于细胞质内,具嗜酸性;少数位于细胞核内,具嗜碱性;也有细胞核内和细胞质都存在的类型。
寄主细胞被病毒感染后形成的蛋白质结晶体,内含有1至几个病毒粒子。
二、四类病毒及其繁殖方式
(一)原核生物的病毒——噬菌体
噬菌体即原核生物的病毒,包括噬细菌体、噬放线菌体和噬蓝细菌体等。
据Bradley(1967)归纳,噬菌体共有6类形态。
1、噬菌体的繁殖
繁殖:病毒侵入寄主细胞后,利用寄主细胞提供的原料、能量和生物合成机制,在病毒核酸的控制下合成病毒核酸和蛋白质,然后装配为病毒颗粒,再以各种方式从细胞中释放出病毒粒子的过程。又称为复制。
病毒粒不存在生长过程。同种病毒粒之间不存在年龄和大小之分。
▲烈性噬菌体(Virulent phage):侵入寄主细胞后进行复制繁殖,并导致细胞裂解的噬菌体。
▲温和性噬菌体(Temperate phage):侵入细胞后与宿主细胞同步复制,并随宿主细胞的生长繁殖而传代下去,在一般情况下不引起宿主细胞裂解的噬菌体。
温和噬菌体特点:① 都是dsDNA;② 溶源菌。
(1)吸附
吸附:噬菌体用尾丝的末端吸附在相应的宿主的表面。
噬菌体通过附着在细胞表面的特异性受体(蛋白质或多糖)侵染宿主。
吸附过程决定于:
a、细胞表面受点的结构;b、噬菌体的吸附器官;c、温度等。
一种细菌细胞表面可被多种和多个噬菌体吸附感染。一般情况下,一个细菌表面吸附250~ 360个噬菌体达到饱和量。
大肠杆菌表面吸附的T4噬菌体
(2)侵入
噬菌体以尾部固着于敏感细菌细胞表面,将尾丝展开固着于细胞,尾部的溶菌酶水解宿主细胞壁的肽聚糖,使细胞壁产生一个小孔,然后尾鞘收缩,将头部的核酸通过中空的尾髓压入细胞内,而蛋白质外壳则留在细胞外。此过程可在几十秒内完成。
v 只有遗传物质注射进入宿主,留下空蛋白外壳在胞外。
v 通常一种细菌可同时受到几种噬菌体的侵染,但只允许一种噬菌体进入细胞。往往先进入的噬菌体可排斥或抑制后进入者。即使进入了,后进入者也会因不能增殖而消亡。
(3)增殖
包括噬菌体核酸的复制和蛋白质的合成。
烈性噬菌体的复制:噬菌体进入宿主细胞后立即以噬菌体DNA为模板,利用宿主原有的RNA合成酶合成出早期的mRNA,由早期mRNA翻译成早期蛋白质。然后开始噬菌体核酸的复制。在DNA开始复制后转录的mRNA为晚期mRNA,再由晚期mRNA翻译成晚期蛋白质即噬菌体外壳的结构蛋白,如头部蛋白质、尾部蛋白质。
(4)成熟(装配)
把已经合成的各种“部件” 装配成一个成熟的、有侵染力的噬菌体粒子的过程。
过程:先是DNA的凝聚,头、尾和尾丝各自组成。然后按从头到尾的顺序自我装配,形成一个完整的噬菌体。
(5)释放
释放——子代噬菌体由于细菌的裂解而被释放出来,再去侵染其它的细菌。
裂解:脂肪酶水解细胞膜、溶菌酶水解细胞壁
大肠杆菌的T偶数噬菌体从吸附到粒子成熟释放大约需要15 ~30 min。
可见,病毒分两个阶段存在:胞外阶段(病毒粒形式)和胞内阶段。
2、噬菌体效价的测定
效价:指每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数,又称噬菌体斑形成单位数。PFU
噬菌斑 /空斑/“负菌落” 根据噬菌斑的形状可做鉴定指标。
噬菌斑的形状
测定效价方法很多,较常用且较精确的方法是双层平板法。p72
操作方法:
优点:
3、一步生长曲线
由Max Delbruck 和Emory Ellis于1939年建立的一步生长实验,标志着现代噬菌体研究的开始。
利用烈性噬菌体 的生活周期测定噬菌体侵染和成熟病毒体释放的时间间隔,用于估计每个被侵染的细胞释放出来的新的噬菌体粒子数量的生长曲线,称为一步生长曲线。
(1)潜伏期
指从噬菌体吸附到宿主细胞开始,到宿主细胞释放第一个成熟的噬菌体为止的一段时间。包括了吸附、侵入、生物合成和装配阶段。 包括隐晦期和胞内积累期。
隐晦期:宿主细胞内不含任何完整的、有感染性的毒粒。
胞内积累期:感染毒粒增加,但不释放任何毒粒。
(2)裂解期
指噬菌斑突然上升的时期,即细菌细胞正被大量裂解。
(3)平稳期
指感染后的宿主细胞已经全部裂解,溶液中噬菌体效价达到最高点的时期。
可见,一步生长曲线定量描述了烈性噬菌体的生长规律。它可反映每种噬菌体的3个重要特性参数:潜伏期、裂解期和裂解量。
裂解量:是每个感染细菌所释放的新噬菌体的平均数量。
当37℃大肠杆菌被T4噬菌体感染后,大约30 min达到生长高峰,裂解量为大约每个细胞产生100个或更多个毒粒。隐晦期长约11~12 min,潜伏期长21~22min左右。
一步生长曲线的基本实验步骤: p73
为什么可以隔时取样测效价?敏感细菌如E.coli 的培养物与噬菌体颗粒混合,噬菌体在短时间内吸附于它们的宿主细胞。然后高倍稀释该培养物,以至任何从宿主细胞裂解中释放的病毒颗粒不会立即感染新的细胞。这种策略是可行的,因为噬菌体没有找到宿主细胞的主动途径,而必须通过溶液的随机运动接触宿主细胞,因而在稀释的混合物中噬菌体多数不能接触到宿主细胞。然后可以在不同时间间隔取样用噬菌斑计数的方法检测从细菌中释放的感染性噬菌体的数目。
4、溶源性
▲溶源性:是温和噬菌体侵入后并不立即引起宿主细胞裂解的特性。
温和性噬菌体侵入到宿主细菌细胞后,其DNA可整合到宿主细胞的染色体上,并随宿主细胞染色体DNA的复制而进行同步复制,但不合成自己的蛋白质壳体,宿主细胞不裂解而能继续生长。
凡能引起溶源性的噬菌体称为温和性噬菌体/原噬菌体;
含有温和性噬菌体的宿主细胞称为溶源性细胞。溶源菌。
各种细菌、放线菌都有溶源菌。
λ噬菌体是迄今研究得最清楚的一种温和噬菌体。
溶源性细胞/溶源菌的特性的特性:
(1)溶源细胞的裂解
- 在溶源菌中极少数(约10-6)会发生温和噬菌体大量复制、成熟,导致宿主细胞裂解,这种现象称为溶源细菌的自发裂解。
- 若用低剂量的紫外线照射处理或其它物理、化学方法处理,能够诱发溶源细胞大量溃溶,释放成熟噬菌体粒子,这就是溶源细菌的诱发裂解。即:溶源性是可逆的,原噬菌体可被诱导再次活化,并裂解宿主。
(2)溶源细胞的免疫性
Ø 溶源菌中有一种阻遏蛋白,阻遏蛋白能阻遏进入溶源菌的其它同型噬菌体的基因组,使其不能在该细胞内复制。也就是说,它们对于相同病毒的再感染具有免疫性。因此溶源细菌对同型噬菌体呈现一种特异的“免疫”现象。
(3)溶源性细菌的复愈
Ø 溶源性细菌细胞有时可在无理化因子影响条件下既不发生自发裂解,也不发生诱发裂解而消失其含有的温和噬菌体,成为非溶源性细胞,称为溶源细胞的复愈或非溶源化。
(4)溶源性转换
Ø 温和噬菌体可诱导宿主细胞表型改变,这种改变与其生命周期是否完成没有直接关系,这种改变称为溶源性转变。通常涉及细菌表面特征、或致病性的改变。
例如,当沙门氏菌被一种ε噬菌体感染后,其外层脂多糖层结构可能被修饰,这种噬菌体改变了与脂多糖中糖类组分构成有关的几种酶的活性,从而改变了宿主的抗原性,这种ε噬菌体诱导的改变消除了表面的噬菌体受体,可阻止其它ε噬菌体对溶源菌的感染。
温和噬菌体的三种存在形式:
Ø 游离态:指成熟后被释放并具有浸染性的游离噬菌体粒子。
ü 整合态:已整合到宿主基因组上的状态。 此时的噬菌体又称为前噬菌体
即:溶源菌内噬菌体基因组的潜伏形式为原噬菌体
· 营养态:前噬菌体经外界理化因素诱导后,脱离宿主核基因而处于积极复制、合成和装配的状态。
噬菌体毒性感染和溶源性过程图
温和噬菌体特点:
① 细菌的溶源性具有遗传性,产生子代细胞也具有溶源性;
② 有少数噬菌体可自发裂解or诱发裂解宿主细胞;
③ 溶源性细菌在培养中一般不易被察觉,只有用非溶源性敏感菌株混合培养在培养基上形成噬菌斑才可被觉察到。
检验某菌株是否为溶源菌的方法:p73
小结:在某些条件下有产生噬菌体颗粒潜力的细菌被称为溶源菌或溶源体;能进入这种关系中的噬菌体是温和噬菌体。保留在宿主细胞中,但不损伤宿主的病毒基因组潜伏形式称为原噬菌体。原噬菌体通常被整合入细菌基因组,但有时也独立存在。诱导是在溶源化培养中启动噬菌体复制的过程,可以导致感染细菌破坏,并释放出新的噬菌体,即裂解周期的诱导。
(二)植物病毒
1、概述
是最先发现、提纯结晶和电镜观察到的病毒。已知植物病毒有700多种(1989),多数是单链RNA病毒,一般无包膜。
植物染毒后,症状主要有三种:
① 叶绿体不能行使正常功能而引起花叶、黄化或红化等;
② 植株发生矮化,丛枝或畸形等;
③ 形成枯斑或坏死等症状。
2、“侵入”方式
本身没有特殊吸附结构。
(1)借昆虫刺吸式口器刺破植物表面侵入;
(2)通过植物的天然创口或人工嫁接时的创口侵入;
(3)通过胞间连丝或输导组织迅速扩散而引起普遍感染。
- 与噬菌体不同的是,植物病毒必须在侵入宿主细胞后才脱去衣壳。
(三)人类和脊椎动物病毒
Ø 病毒在人体与哺乳动物中普遍存在,其它各类动物中也广泛存在着相应的病毒。
Ø 家畜中的口蹄疫、猪瘟、牛瘟、马传染性贫血、兔乳头状瘤等;
Ø 家禽中的瘟疫病,两栖类、鱼类的肿瘤、鱼痘等都是病毒引起的;
Ø 人类80%的传染病(如流行感冒、肝炎、麻诊、水痘、腮腺炎、流行性乙型脑炎、脊髓灰质炎、狂犬病等)是受病毒感染而诱发的。
Ø 这些病毒病至今还缺少有效的对付手段,它们大量增殖,导致宿主细胞裂解死亡。
导致细胞死亡的感染称为杀细胞感染。
动物病毒可以多种方式损伤宿主细胞,经常导致细胞死亡。
持续、潜伏和慢性毒感染:
许多病毒感染为急性感染,即发病相当快而持续时间相对短。
然而有些病毒可以产生持续感染,持续数年时间。
潜伏病毒感染,病毒处于潜伏状态,没有症状、没有相应抗体、没有病毒检出。例如单纯疱疹病毒。
持续和潜伏感染的精确机理并不清楚。
有一小类病毒可产生极慢过程的感染。慢性病毒感染中,病毒几乎一直可以检出,临床症状轻微或长时间不出现临床症状。例如HBV病毒和HIV病毒。
Ø 一些病毒感染动物后,并不致死宿主细胞,而是引起肿瘤。人的肿瘤特别是恶性肿瘤已证明不是由病毒引起,但病毒可诱导人产生恶性肿瘤。
艾滋病:获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。
HIV病毒:人类免疫缺陷病毒,引起艾滋病的病毒。
HIV病毒 SARS冠状病毒的结构示意图
禽流感病毒 乙型肝炎病毒(HBV)
(四)昆虫病毒
概况:目前已知的从昆虫体内分离到的病毒有1671种(1990),其中80%来自鳞翅目昆虫。
寄生:主要寄生在昆虫的真皮、脂肪组织、血细胞、肠道细胞中,有的在宿主的细胞核中,有的在宿主的细胞质里,大量增殖导致宿主组织破坏、死亡。
多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体,称为多角体。内包裹着数目不等的病毒粒。
分类:根据是否形成多角体和多角体的形态及形成部位,把昆虫病毒分为3类:
核型多角体病毒:一类在昆虫细胞核内增殖的、具有蛋白质包涵体的杆状病毒,数量最多;
质型多角体病毒:一类在昆虫细胞质内增殖的、可形成蛋白质包涵体的球状病毒;
颗粒体病毒:具有蛋白质包涵体,每个包涵体内仅含一个病毒粒。
第二节 亚病毒
亚病毒:凡是只含有核酸或蛋白质一种成分的分子病原体。
亚病毒种类:类病毒、拟病毒、朊病毒。
一、类病毒
类病毒:只含RNA成分。目前只在植物体中发现。
1970年代马铃薯纺锤形块茎病(PSTD)中发现。
典型的类病毒是PSTD类病毒(PSTV)。 p77图3-14
二、拟病毒
拟病毒:指一类包裹在真病毒粒中的有缺陷的类病毒
又叫类类病毒或病毒卫星。
个体极其微小,一般仅由裸露的RNA或DNA所组成。
u 被拟病毒“寄生”的真病毒称辅助病毒,拟病毒就成了它的卫星。拟病毒的复制必须依赖辅助病毒的协助。
u 目前共发现四种,三种在植物中,一种在动物中发现,即丁型肝炎病毒(HDV)。HDV含ssRNA,它的“宿主”即辅助病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。
三、朊病毒
Ø 与类病毒和拟病毒不同,朊病毒不含RNA(或核酸),只含传染性蛋白质分子。
Ø 损伤中枢神经。比如羊瘙痒病、疯牛病、克-雅氏病(人类一种老年性痴呆病)都是由朊病毒引起的。
Ø 借食物入侵。
Ø 朊病毒的特点:p78
1997年,美国科学家 S.Prusiner“朊病毒的发现”获得诺贝尔奖。
第二节 病毒与实践
一、噬菌体与发酵工业
噬菌体:原核生物的病毒,通常指噬细菌体和噬放线菌体。
噬菌体来源:
① 生产菌本身携带噬菌体(此时菌种需分离纯化);
② 生产环境存在噬菌体;
③ 相近类型的噬菌体发生变异使其对产生菌敏感而感染。
感染噬菌体后的表现:
① 发酵周期明显延长;
② 碳源消耗缓慢;
③ 发酵液变清;
④ 在短时间内菌体大量自溶,发酵产物形成缓慢或根本不形成;
⑤ 噬菌体检测会发现大量噬菌斑;
⑥ 电镜可看到噬菌体。
感染噬菌体的后果: ① 减产; ② 倒罐; ③ 停产。
感染噬菌体后的处理:
① 发酵液用高压蒸汽灭菌后放掉,严防发酵液任意流失;
② 全部停产,对环境进行全面清洗和消毒;
③ 更换生产菌种,不断筛选抗噬菌体的菌种。
预防措施:
发酵工业防止噬菌体污染的原则是防重于治。
① 决不使用可疑菌种,选育抗噬菌体突变菌株(必要时添加噬菌体的抑制剂);
② 严格环境卫生,设备定时拆洗,菌种培养室和无菌操作室定期消毒以保持无菌状态;
③ 活菌液严禁排放;
④ 通气、加料严控。保证无菌空气净化系统严密有效,发酵过程的取样要严密等;
⑤ 严防种子携带噬菌体进入发酵罐(种子液要进行严格的噬检);
⑥ 设备灭菌,彻底消除设备死角及渗漏、排除隐患;
⑦ 严格执行制度。
二、昆虫病毒用于生物防治
三、病毒在基因工程中的应用
在基因工程中, 除原核生物的质粒外,病毒是最好的载体。 包括噬菌体、动物病毒、植物病毒、昆虫病毒。
Ø 在原核生物基因工程中,常用的载体是λ-噬菌体;
- 在动物基因工程中,常用的载体是SV40(猴病毒40);
- 在植物基因工程中,常用的载体是花椰菜花叶病毒(CaMV);
- 在昆虫基因工程中,常用的载体是杆状病毒。
《基因工程》内容,课后阅读。