1.5.1 PCR的操作注意事项
◆模板: PCR所用的模板一般稀释至纳克数量级,并保存于-20。C。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。当使用高分子量的DNA(>10kb)作模板时,如用限制性内切酶先行消解(靶序列中没有此酶切位点),则扩增效率更好。 PCR所用的模板一般使用量为: 哺乳动物基因组DNA 1.0ug DNA。 酵母 1~10ng 细菌 10ng~100ng 质粒 0.1ng~10ng ◆引物: 标准PCR反应(不限制引物数量)每条引物的典型浓度时0.1~0.5umol/L(即6×1012~3×1013个分子)。该浓度扩增1kbDNA片段少于30个循环的PCR反应绰绰有余,更高浓度的引物可能引起错配,导致非特异性扩增。 买来的引物应先离心几秒钟后,加入一定量的TE至引物浓度为40μM,保存于-20。C。 使用时,稀释成20uM,避免反复冻融。 ◆dNTP: 在MgCl2 1.5mmol/L条件下,每种dNTP的浓度一般在200~250umol/L之间。 高浓度dNTP(>4mmol/L)对扩增反应起抑制作用。因为dNTP与Mg2+螯合而引起。如扩增片段在约1kb长度。每种dNTP浓度控制在20 umol/L至0.5~1.0pmd/L,可能会使扩增产物获得满意产率。 普通PCR用的dNTP浓度为2.5mM,保存于-20。C避免反复冻融。 在-20。C长期保存的dNTP少量水分会蒸发,然后凝结在管壁上,因此使用前要离心几秒钟。 ◆Mg2+: 通常缓冲液中Mg2+最佳浓度时1.5mmol/L。 适当增加Mg2+浓度可以减少非特异性引导。 ◆DNA聚合酶:常规PCR。 rTaqE每个标准的25~50ul反应体系用0.5~2.5单位。 |
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