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分子标记技术主要可以分为两类, 基于杂交的标记技术和基于PCR 的标记技术。 作为一个理想的分子标记技术, 应该具有多态性、稳定性( 即不受环境或外在因素的影响) 、在整个基因组中分布的广泛性、易于观察和操作、廉价、共显性、重复性好等。 目前常用的分子标记技术主要有限制性片段长度多态性( RFLP) 、随机扩增多态性DNA( RAPD)、扩增片段长度多态性( AFLP) SRAP 标记是在总结已有的DNA 分子标记优缺点的基础上开发的一种新的基于PCR 的DNA 分子标记技术。SRAP 标记克服了随机扩增多态DNA（RAPD）重复性、稳定性差的缺点；不需要像限制性片段长度多态性（RFLP）标记那样要求高纯度和高浓度的DNA和使用放射性同位素, 也不需像扩增片断长度多态性（AFLP）那样需要预扩增和连接等烦琐的操作,从而减少了对人力、物力的需求和依赖。重要的是,SRAP 具有简单、高效、高共显性、重复性好、易测序等优点,尤其它可以检测基因的可译读码框(ORFs) 区域,从而提高了扩增结果与表现型的相关性。 目前SRAP 已开始在植物种质资源鉴定评价、种缘进化关系、遗传图谱构建、基因定位、重要性状标记以及比较基因组学方面得到成功应用。 SRAP 标记 美国加州大学蔬菜作物系Li 和Quiros（2001）提出的序列相关扩增多态性( sequence-related amplifiedpolymorphism, SRAP)是一种基于PCR的标记技术。它针对基因外显子里GC 含量丰富而启动子和内含子里AT 含量丰富的特点来设计引物进行扩增, 因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。SRAP 标记具有简便、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点, 在基因组中分布均匀, 适合基因定位、基因克隆、遗传图谱构建等生物学研究。 SRAP 标记的原理 在SRAP 分子标记中，PCR扩增引物的设计是关键, 它利用独特的引物设计对ORFs ( open reading frames, 开放阅读框)进行扩增。正向引物长17 bp, 5’端的前10 bp 是一段非特异性的填充序列, 紧接着是CCGG, 它们一起组成核心序列, 然后是靠着3’端的3 个选择性碱基, 对外显子进行扩增。反向引物长18 bp, 即由5’的11 个无特异性的填充序列和紧接着的AATT 组成的核心序列, 及3’的3 个选择性碱基, 对内含子和启动子区域进行特异扩增; 因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性扩增产物。 SRAP 分子标记的技术流程 SRAP 标记的引物设计 SRAP 标记分析中共有两套引物, 长为17 bp 的正向引物和长为18 bp 的反向引物, 也有用19 bp 反向引物的。长为17 bp 的正向引物由14 bp 的核心序列和3’ 端的3 个可选择性碱基组成, 核心序列由端的10 个填充序列和紧接着的CCGG 组成。3 个可选择性的碱基是可以变化的, 它的变化能产生一系列的引物,它们有着共同的核心序列。反向引物的组分和正向引物相同, 只是在填充序列和3 个可选择性碱基之间是AATT。引物设计时有一个原则, 就是引物之间不能形成发夹结构或其它的二级结构, GC 的含量在40%～50%之间,正向和反向引物的填充序列在组成上必须不同, 长度为10 或11 个碱基。使用同位素检测时引物可用33P-ATP 进行标记。 SRAP -PCR 扩增 PCR扩增反应模板可以是基因组DNA, 也可以是cDNA。 扩增的过程采用复性变温法, 前5 个循环复性温度为35℃, 后30～35 个循环则为50℃, 这种温度的变化确保DNA扩增在前5 个循环是有效的, 并且在以后的循环中以指数方式扩增。 扩增后的DNA 片段可用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离, EB、银染或放射自显影检测。 扩增产物测序 扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后, 从胶上割下获得SRAP 标记差异片段, 回收后, 用相应引物直接测序。由于SRAP 产生高强带,很少有重叠, 而且引物较长, 故比AFLP 更易测序。 SRAP 标记的特点 SRAP 操作简便。它使用长17～18 bp 的引物以及变化的退火温度, 保证了扩增结果的稳定性。通过改变3’端3 个选择性碱基可得到更多的引物, 同时由于正向引物和反向引物可以自由组配, 因此用少量的引物可进行多种组合, 大大减少了合成引物的费用, 同时也大大提高了引物的使用效率。每个引物组合产生的多态性条带数目, SRAP高于RAPD。 由于在设计引物时正反引物分别是针对序列相对保守的外显子与变异大的内含子、启动子与间隔序列,因此, 多数SRAP 标记在基因组中分布是均匀的。能够比较容易地分离目的标记并测序等, 高频率的共显性以及在基因组中均匀分布的特性将使其优于AFLP 标记而成为一个构建遗传图谱的良好标记体系。 SRAP 标记的应用 遗传多样性分析 由于在不同的种、不同个体间具有一定的多态性,SRAP 技术已成功应用于种质资源的鉴定与评价工作。SRAP 标记比AFLP、RAPD 等其它方法提供更优良的信息。在遗传多样性的研究中, SRAP 确实比AFLP 更能反映表型的多样性及进化历史, 这可能是因为它对ORFs 进行扩增, 而ORFs 是基因的重要组成部分, 基因的多样性更能反映遗传资源的多样性。 遗传图谱的构建 自1980 年Bostein 等提出用RFLP 构建遗传图谱以来, 现在已构建了很多生物的RFLP 遗传图谱, 但大多数密度很低, 因此需要构建高密度的遗传图谱。用RAPD 技术作图重复性差, 一次实验不能得到大量的多态性片段。用AFLP 技术作图, 可以得到高密度的图, 但该技术难度大, 费用高, 也没有得到广泛应用。而SRAP 技术简便、稳定, 适用于遗传作图。 重要性状的标记 在动植物中, 如果一些重要性状能够标记出来, 那么在以后的新品种的选育、性状标记的辅助选择等方面都具有重大的作用。Li 等( 2003) 在大白菜中发现了一个与雄性不育基因有关的SRAP 标记， 在芹菜中获得了一个与病毒抗性基因紧密连锁的SRAP 标记。 比较基因组学 研究比较基因组学对研究物种的起源和进化都具有很重要的意义, 而转录图谱是进行比较基因组学研究极为有效的手段, 利用基于PCR 的cDNA-SRAP 分析来检测编码区的多态性具有简便、快捷、高效的特点。 SRA的缺点 由于它是对ORFs 进行扩增, 因而对基因组相对较少的着丝粒附近以及端粒的扩增会较少, 如果结合可扩增这些区域的SSR 标记, 那将可获得覆盖整个基因组的连锁图。 |
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