茶 咖啡碱测定

茶  咖啡碱测定

Tea—Determination of caffeine content

GB/T8312—2002(eqv ISO107272:1995)代替GB/T8312—1987

1  范围

本标准规定了用高效液相色谱法、紫外分光光度法对茶叶中咖啡碱测定的原理、仪器和用具、试剂和溶液、操作方法及结果计算方法。

本标准适用于茶叶中咖啡碱的测定。

2  引用标准

下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

GB/T8302—2002  茶  取样

GB/T8303—2002  茶  磨碎试样的制备及其干物质含量测定

第一法  高效液相色谱法

3  原理

茶叶中咖啡碱经沸水和氧化镁混合提取后，经高效液相色谱仪、C₁₈分离柱、紫外检测器检测，与标准系列比较定量。

4  仪器和用具

实验室常规仪器及下列各项：

4．1  高效液相色谱仪。

4．2  紫外检测器：检测波长280nm。

4．3  分析柱：C₁₈（ODS柱）。

4．4  分析天平：感量0.0001g。

5  试剂和溶液

甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。

5．1  氧化镁：分析纯。

5．2  高效液相色谱流动相：取600mL甲醇倒入1400mL重蒸馏水，混匀，脱气。

5．3  咖啡碱标准液：称取125mg咖啡碱（纯度不低于99%）加乙醇：水（1：4）溶解，定容至250mL。使用时，待标准液至室温后，取2mL加水至100mL作为工作液。

6  操作方法

6．1  取样

按GB/T8302的规定。

6．2  试样制备

按GB/T8303的规定。

6．3  测定步骤

6．3．1  试液制备

称取1.0g（准确至0.0001g）磨碎茶样（6.2），置于500mL烧瓶中，加4.5g氧化镁及300mL沸水，于沸水浴中加热，浸提20min（每隔5min摇动一次），浸提完毕后立即趁热减压过滤，滤液移入500mL容量瓶中，冷却后，用水定容至刻度，混匀。取一部分试液，通过0.45μm滤膜过滤，待用。

6．3．2  色谱条件

6．3．2．1  检测波长：紫外检测器，波长280nm。

6．3．2．2  流动相：水：甲醇的体积分数为7：3。

6．3．2．3  流速：0.5mL/min～1.5mL/min。

6．2．2．4  柱温：40℃。

6．2．2．5  进样量：10μL～20μL。

6．3．3  测定

准确汲取制备液（6.3.1）10μL～20μL，注入高效液相色谱仪，并用咖啡碱标准液（5.3）制作标准曲线，进行色谱测定。

7  结果计算

7．1  计算方法

比较试样和标准样的峰面积，按式（1）计算：

……………………………（1）

式中：C₁——测定液中咖啡碱含量，μg；

L₁——样品总体积，mL；

L₂——进样体积，μL；

M₁——试样的质量，g；

m₁——试样干物质含量，%。

如果符合重复性（7.2）的要求，取两次测定的算术平均值作为结果，结果保留小数点后一位。

7．2  重复性

同一样品的两次测定值之差，每100g试样不得超过0.2g。

 

第二法  紫外分光光度法

8  原理

茶叶中的咖啡碱易溶于水，除去干扰物质后，用特定波长测定其含量。

9  仪器和用具

实验室常规仪器及下列各项：

9．1  紫外分光光度仪。

9．2  分析天平：感量0.001g。

10  试剂和溶液

所用试剂应为分析纯（AR），水为蒸馏水。

10．1  碱式乙酸铅溶液：称取50g碱式乙酸铅，加水100mL，静置过夜，倾出上清液过滤。

10．2  盐酸：0.01mol/L溶液，取0.9mL浓盐酸，用水稀释1L，摇匀。

10．3  硫酸：4.5mol/L溶液，取浓硫酸250mL，用水稀释1L，摇匀。

10．4  咖啡碱标准液：称取100mg咖啡碱（纯度不低于99%）溶于100mL水中，作为母液，准确汲取5mL加水至100mL作为工作液（1mL含咖啡碱0.05mg）。

11  测定步骤

11．1  试液制备

称取3g（准确至0.001g）磨碎试样（6.2）于500mL锥形瓶中，加沸蒸馏水450mL，立即移入沸水浴中，浸提45min（每隔10min摇动一次）。浸提完毕后立即趁热减压过滤。滤液移入500mL容量瓶中，残渣用少量热蒸馏水洗涤2～3次，并将滤液滤入上述容量瓶中，冷却后用蒸馏水稀释至刻度。

11．2  用移液管准确吸取试液（11.1）10mL移入100mL容量瓶中，加入4mL0.01mol/L盐酸（10.2）和1mL碱式乙酸铅溶液(10.1)，用水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤，准确吸取滤液25mL，注入50mL容量瓶中，加入0.1mL4.5mol/L硫酸溶液(10.3)，加水稀释至刻度，混匀，静置澄清过滤。用10㎜比色杯，在波长274nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度（A）。

11．3  咖啡碱标准曲线的制作

分别吸取0、1、2、3、4、5、6mL咖啡碱工作液（10.4）于一组25mL容量瓶中，各加入1.0mL盐酸（10.2），用水稀释至刻度，混匀，用10mm石英比色杯，在波长274nm处，以试剂空白溶液作参比，测定吸光度（A）。将测得的吸光度与对应的咖啡碱浓度绘制标准曲线。

12  结果计算

茶叶中咖啡碱含量以干态质量分数表示，按式（2）计算：

……………………………（2）

式中：C₂——根据试样测得的吸光度（A），从咖啡碱标准曲线上查得的咖啡碱相应含量，mg/mL；

L₃——试液总量，mL；

M₂——试样用量，g；

m₂——试样干物质含量，%。

如果符合重复性(7.2)，取两次测定的算术平均值作为结果，保留小数点后一位。