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各位分生研究高手:你们好!
我将目的基因(1911bp)与 pcDNA3.1连接,用T4DNA连接酶,目的基因与载体的浓度比相等,目的基因与载体均采用两步酶切(Xbal 1 和EcoR 1酶)法,37度,16h.因pcDNA3.1载体无蓝白筛选,只好盲挑克隆菌株,但已经克隆了7次,均未成功.急请高人指导!多谢!多谢!!!! 我的经验是目的基因的比例一定要大，应为质粒的3～10倍，pcDNA3.1是有抗性的啊，你只能挑菌提质粒酶切鉴定的 1 感受态是不是有问题(问题经常在这里) 2 你的目的基因是直接pcr出来的然后酶切的吗?如果是,加保护碱基没有,如果没加的话,酶切效率可能会比较低. 3双酶切一般不会自连,如果自连长斑的话可能是其中一种酶没有完全切开. 建议:用一下商品化的T 载体,看看究竟哪步出了问题. 1、首先你要保证载体及目的片段都完全切开。 2、目的片段的量要大，即在紫外灯下很亮。 3、胶、电泳液和染色液都用新配的。 4、温度不要太低，连接时间长一点。 一般来说不会有太大问题。祝好运！！ 谢谢指教！质粒是Amp+的，在LB Amp+的培养基上长的单克隆菌，我已挑出了许多个（60-70），但不幸的是无一个是载有目的基因的阳性克隆！你的经验是目的基因比例要大意些，能否指教一下具体的浓度？谢谢！ 双酶切，没有理由连不上的，看你的情况长了那么多单克隆菌落，应该有。不要急着一遍又一遍的重复做，先静下心分析一下。 你确定没有阳性克隆吗？质粒的提取是否有问题，质粒的质量不好，有些限制酶会切不动，先做一下PCR看看？ 转个切开的载体看看，是不是也能长那么多菌落？ 多谢各位好心的高手们！！ 我的目的基因是PCR后立即进行的酶切，引物设计时加了保护碱基。而且每次酶切后都进行了切胶纯化，目的基因的泳带也很亮，电泳缓冲液等均是新配的，可能最大的问题是目的基因与质粒的浓度比不够，要大出那么多倍，真的是有很大的差距！ 连接的温度要高一些？多少度最适宜？请指教！ 由衷的道一声谢谢！！！ 连接的温度：如果是粘端连接4度就可以了啊。我连过几次，很好啊！如果是平端连接16度20小时。 感受态菌Top 10是新转化的，已经验证一点问题都没有！ 你的PCR产物可以先连T载体。再酶切，不然你每次都PCR，你可以连了T载体后测序一下，努力！ 我用的是T4连接酶，酶切形成的是拈性末端，真的只需4度就可以了吗？ 质粒提取没问题，很纯，亮度也很好，或许是两种酶中的一种没切开，造成了质粒自身环化。谢谢！ 请教：T载体可以连接任何目的基因吗？是否也需要进行双酶切后才能进行连接？也用T4连接酶吗？谢谢！ 不同的保护碱基有不同的酶切效率，你可以去查biolab的目录，另外，对于比较大的片段常规方法是先连接到T-vector上然后进行双酶切，因为这样比较保险；太小的片段才直接酶切，因为小片段的酶切回收是很麻烦的。你的片段这么长，所以建议你最好将pCR产物装进t载体中再做酶切，另外再测一下序就更保险了。 不要担心，我相信肯定可以做出来。 ...ljq:你好！ 真诚的谢谢你的指教！在分生领域我是新兵，更确切的说在这条研究路上我刚刚抬起脚，道路充满了荆棘与坎坷！苦啊！有了你们的热心帮助，我会少摔一些跤，少走一些弯路。再次表示感谢！ ...ljq:你好！ 真诚的谢谢你的指教！在分生领域我是新兵，更确切的说在这条研究路上我刚刚抬起脚，道路充满了荆棘与坎坷！苦啊！有了你们的热心帮助，我会少摔一些跤，少走一些弯路。再次表示感谢！ 还有一个问题急待解答：pcDNA3.1在16度中酶切，EcoR1酶和Xba 1酶大约需要几小时才能切开？请有经验的高手在百忙中指点。谢谢！ 可能会切不开，因为有次别人把我的水浴锅关了，我用EcoR1酶切了一个晚上也没切开。温度在20度左右吧。 1、粘端连接4度过夜就可以。我用过很多次。 2、T载体和PCR产物直接连。因为PCR产物会在末端加A，和T载体可以直接相连（有的Taq酶是不加A的），不用连接酶的。我用大连宝生物的T载体。用法看说明书。很简单 我也遇到这种情况，有些载体就是切不下来，原因也不清楚，你可以把LB Amp+的培养基上长的单克隆菌作个PCR鉴定，如果没有目的片段，建议换换载体。 60-70个假阳性克隆，说明载体酶切不全。 要严格按照实验程序，做阳性对照，阴性对照。 感受态最好每次新作。 多谢各位的无私指教！我会参照诸位的宝贵经验，认真找出我屡遭失败的确切原因的。Thank you very much! 对于没有蓝白斑筛选的连接，你一定要做一个空载体对照。就是用两个管子，一个加切好的质粒和目的基因，另一个只加质粒然后用水补齐体积，用同样的条件做连接和转化，平行进行。 第二天来，比较两个盘子的菌落数量，如果数目相当的话，你就不用费劲去提质粒了，你的连接肯定不行。所有步骤重新来过。 如果有目的基因的盘子比空白对照的菌落多很多，说明你的连接有希望，可以提质粒看看。通常我做的好的时候，空白对照盘只有一两个菌落，而有基因的盘子上一大片。至少也要有10倍以上的差别。 还要注意一点，你的载体去磷酸化一定要做好，防止自连。这样可以大大提高连接效率。如果空白对照上有很多菌落，说明载体自连严重。 你用我说的对照法试试吧，什么问题就一目了然了。 你的载体酶切后是否回收过？我建议你将载体酶切后跑胶然后回收纯化，再作连接！这样你的假阳性克隆就会少很多，而且连接效率会很高！ 1.首先要保证目的基因和载体都正确切开，尤其是插入片段，如果是切pcr产物，那么限制性酶用量要加大几倍。建议你将pcr片段先克隆到T vector上再切。 2.选择合适的T4 DNA连接酶，roche和invitrogen的比较好。按照说明书做，说明书建议的系统组成往往是最佳条件。DNA和酶量大不一定好，过犹不及。 3.选择合适的感受态细胞，主要是转化率要高。有时用于表达的菌株不容易转化，可先转入其它菌株如Top 10来扩增质粒，然后再转入表达用宿主菌。也可用电击转化的方式。 一家之言，希望对你有帮助。祝全天下的生物科研工作者都好运。 我现在也在做连接，但一直没有连接上，请问目的基因和载体除了比例是3：1外，需要用多少ng? 我做的时候没有定量，你如果要定量也可以，目的基因和载体的比例是3：1到10：1，不要定在一个比例上，因为这和你的质粒大小，外源基因片段大小，体系浓度都有关系。检疫你做一些浓度梯度。 做连接关键是目的片断和载体的比例，这里的比例不是简单的体积比，而是二者的摩尔浓度比，将酶切产物回收后，一定要定量，可以跑一下核酸电泳，比较一下二者的亮度，如果目的片断的亮度是载体的两到三倍，则连接时二者取等体积即可，这种方法很有效，不妨试一下 最简单的方法使用磷酸酶处理已经切割的载体. 多做一些酶切,一次回收,全部用来连接. 两者比例应是接近7:1啊!连接酶说明上有,根据大小自己算啊! 分子克隆上有一句话，说是如果在质粒提取时省略了用平衡酚：氯仿抽提一步会得到耐DNA酶切的质粒，不知跟你的问题有没有关系？ 另外，哪位知道为什么会出现耐酶切的这种情况？二版没有说明，三版还没下到。 请教一个问题，我的目的基因有3.5KB，为了保证突变较少，我用Pfu酶核Taq酶一起跑PCR，我很幸运跑出来了，但是，若我想和T载体连接的话，Pfu酶产生的产物是平端，那怎么和T载体连呢？请指点迷津！ 怎么还没有人回答呢？加急！！ 诚挚的感谢各位高手和朋友！我是的新会员，在酶连接、克隆载体的实验中遇到了很大的阻力，再挫折和彷徨中得到了各位高手和朋友的热情帮助和指点，心理感到十分温暖和鼓舞，收益非浅！再次感谢、感谢朋友们！听了各位的指教，冷静的进行了分析，质粒没完全切开的可能性很大，我的确也没进行磷酸化处理，只进行了完整空质粒转化的对照而缺乏切开质粒的转化对照。但我想总不会全部没切开吧？所以又重新挑了20多个克隆菌，用菌液扩目的基因，结果扩出了两个，现已送出测序，但愿是我所要的阳性克隆菌！在今后的日子里，尽管我才疏学浅，所知不多，但我也愿意向诸位一样，能给别人以帮助、为他人做有意义的事！！ 我也是在用PCDNA3.1 这个载体， PCR 产物500 bp左右， 两端 用Xba1 ECoR1酶切，可是， PCDNA3.1酶切后有两条带， 于是减少了质粒再酶切，还是有两条带， 是否表示酶切不完全， 还是质粒有问题？ 将这两条带分别和PCR 产物连接， 结果，没有长出细菌，唉， 怎么办？ 感受态没有做对照， 不知道好不好 susan:你好! 你的实验和我的基本相同,只是目的基因短了一点.我进行pcDNA3.1是分两步进行的酶切,每步都进行了切胶纯化,片段泳带很好,在完整质粒带的后面,小的杂带很弱,几乎看不清,没有出现你那种情况.按常规也不会出现你所见得的现象,因为在Xba1和EcoR1之间只有40余个bp,不应该出现两条差不多的分割带. zjf575: 谢谢你的提醒， 现在我也怀疑我的PCDNA3.1的菌种有问题。用什么方法 可以知道它究竟是不是PCDNA3.1呢？因为质粒电泳很难看出大小。 |
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