-- NDV修饰自体肿瘤细胞疫苗
中国医药生物技术协会科技部 李刚毅
中国人民解放军总医院肿瘤内科 韩小红
北京朝阳慈济医院生物治疗中心 许丽南
主 题 词： 自体瘤苗（ATV） 新城鸡瘟病毒（NDV）T细胞（T cell） 主动特异性免疫治疗（ASI）
英 文 缩 写： HN 神经氨酸酶 濮阳市油田总医院普外科张文忠
ATV-NDV NDV修饰自体肿瘤细胞疫苗
TAA 肿瘤相关抗原
TATA 肿瘤相关移植抗原或肿瘤[排斥抗原
TCR 抗原特异性T细胞受体
MHC 主要组织相容性复合体
MLTC 混合淋巴-肿瘤细胞培养
CTL 细胞毒T淋巴细胞
一、概述
在肿瘤基因治疗中，经常采用的手段就是利用病毒作载体，将保护性或治疗性基因直接转移至肿瘤细胞制成瘤苗，但这种手段常受到可感染细胞的数量、组织选择性和应用安全性的限制。本文介绍一种更加安全、有效和组织选择性好的感染人肿瘤细胞的方法--新城鸡瘟病毒（NDV），它是一种禽类的副粘液病毒，具有多组织亲和性（pleiotropic）的免疫刺激特性，能在肿瘤细胞质中选择性地复制而不依赖于细胞的增殖，使用安全。作为一种佐剂，这种病毒临床使用最显著的特点就是它具有诱导T细胞共刺激活性、防止无能诱导和诱导局部趋化因子（如：RANTES、IP-10）和细胞因子（如：IFNα、β，TNFα）的产生。因子影响T细胞的募集和活化。
利用病毒来治疗肿瘤的概念可以追索到本世纪的早期，当时许多有意义的发现引起了人们极大的兴趣，这就是许多肿瘤患者在自然病毒感染后出现肿瘤缓解和自愈现象。（1-3）例如：腮腺炎病毒（4）和风疹病毒（3）感染。从此，便开始了将不同病毒用于临床治疗的尝试，但是，引起了一系列严重问题和副作用，特别是神经毒作用和由于中和抗体的产生而导致的无效。1994年德国国家癌症研究所的杂志社论（5）标志着利用病毒治疗的新纪元。在这篇社论中，NDV被认为是最有希望的治疗性的病毒。
以NDV为基础的疫苗已经成为极具经济价值的兽医药，许多国家已用它保护由致病性NDV引起的非典型性禽类疾病（6）。长期以来，人们已经很清楚的知道NDV具有抗哺乳动物（包括人）肿瘤的形成（7）和免疫刺激的特点（8、9）。与其它类病毒相比，NDV具有相对安全的优点，许多感染过NDV的农场主和实验室工作人员都有这样的经验，即使是感染了野生型的NDV也只是引起轻微的疾病，如轻度关节炎和喉炎。
利用NDV治疗人类肿瘤有三种不同的概念--病毒治疗、非特异性免疫治疗和主动特异性免疫治疗。早期的病毒治疗主要是采用NDV73T和NDV italian 两种溶解性毒株，如NDV73T它能感染人所有类型的肿瘤细胞并在其中复制，引起细胞与细胞的融合和多核体的形成，最终导致肿瘤细胞死亡。由于NDV不能在正常细胞中复制，因此，人们就注意到了NDV介导的对人肿瘤细胞的选择性杀伤作用（10）。在裸鼠实验中，人们观察到了，经过NDV局部治疗后，人异种移殖瘤溶解和完全缓解（11）。但是，这种利用病毒直接注射治疗肿瘤的方法没有进入临床应用，仅限于局部治疗，因为由于人血清中和抗体的存在，病毒不能到达肿瘤转移灶。德国癌症研究中心的进一步实验证实，在人黑色素瘤裸鼠转移模型中，利用NDV Italian 毒株进行系统治疗，没有观察到抗转移效果（12）；利用NDV治疗人肿瘤的第二个概念就是非特异性免疫刺激。在匈牙利，这种治疗方法已经进入临床评估阶段，他们将减毒的禽类病毒疫苗（吸入剂）用于晚期肿瘤病人的治疗。良好的临床应用结果已经发表（13）。在体外将非溶解性毒株NDV ulster感染的人黑色素瘤细胞在注射裸鼠前与过量的非感染黑色素瘤细胞混合后，发现不能发生种植反应。这表明非特异性免疫刺激作用具有很强的抗肿瘤旁观者效应。（12）这就是众所周知的，NDV能激活人免疫细胞产生细胞因子（8、9）和抗肿瘤CTL（14）；第三个概念就是利用NDV作为有效肿瘤疫苗的生物佐剂。其目的就是联合应用疫苗表达肿瘤相关抗原（TAAs）的特异组份和增加肿瘤细胞免疫原性的非特异组份。在早期的开拓性研究工作中，William A.Cassel 用肿瘤溶解性毒株NDV73T制备黑色素瘤裂解物疫苗用于临床治疗（15、16），他在一系列的模式系统中（17）观察到病毒增强了裂解物的抗原性。1983年和1992年，他发表两个令人振奋的改善长期生存率的报告。在这个报告中，83例II期恶性黑色素瘤病人术后接受免疫治疗的五年生存率到达69%而没有接受接种的病人五年生存率只有17%（15、16）。八十年代初，德国癌症研究中心的Schirrmacher教授开始了设计利用非溶解性毒株修饰肿瘤细胞的活细胞疫苗的研究。从此，NDV ulster这个低致病性毒株便被选择用于此目的（18、19）。
二、ATV-NDV的概念和制备
两种组份（特异和非特异）的活细胞疫苗适用于所有尚未鉴定肿瘤排斥抗原的肿瘤。特异性组份就是自体肿瘤细胞，它来自病人手术的新解组织，因为它最能代表和体现肿瘤病人个体所有肿瘤抗原的免疫原性。具有多种潜在肿瘤相关抗原的新鲜分离的肿瘤细胞是一个具有许多异质性克隆的细胞簇，这个总体的细胞群落都能被非溶解性毒株NDV ulster有效感染而修饰。因此，细胞疫苗具有许多优越性。第一，无须鉴定特异性TAAs的存在；第二，经过适当修饰的细胞疫苗可适用多种恶性肿瘤的有效免疫治疗。
NDV作为修饰剂的显著特点是它的细胞结合特性，在几分钟之内，它通过自身的神经氨酸酶分子与包含NDV受体的唾液酸（Sialyl -α-2-3-Gal β1-4）结合（20）。而唾液酸是细胞表面广泛存在的神经节苷脂的组份。在鸡种蛋里繁殖的具有感染性的NDV ulster 标准株包含有经过酶切而具有融合活性的融合蛋白F，病毒与细胞结合后，HN和F介导了病毒外膜和宿主细胞膜的融合作用。包含病毒负链RNA基因组的病毒核壳体通过宿主细胞产生的小孔进入宿主细胞质。ATV-NDV的制备通常是在PBS的环境中进行，每一千万个细胞与32HU NDV ulster温育1小时。细胞疫苗经过200Gy r-射线或MMC处理灭能后就可用于癌症病人的真皮内注射，注射6-24小时内，在接种局部，病毒在感染的肿瘤细胞内复制增殖，增加了病毒分子（如HN）的数量，诱导许多宿主基因产生可溶性因子。如：细胞因子、趋化因子和吖片肽等。这些因子共同改变了接种局部的微环境，导致局部非特异性炎症反应。T细胞通过NDV诱导的趋化因子（RANTES和IP-10）而募集于接种局部，有些T细胞表达T细胞受体（TCR），这些受体与肿瘤细胞表面以MHC-TAAs复合物存在的TAAs肽相互作用介导第一信号的产生，缺乏共刺激分子的肿瘤细胞就不能传递另外的共刺激信号，因此就不能活化肿瘤特异的T淋巴细胞。相反，在ATV-NDV接种局部，由于共刺信号的存在，肿瘤特异性T淋巴细胞就能够活化，一种共刺激信号（信号2）是由病毒HN分子与病毒受体相互作用介导产生，另一种共刺激信号（信号3）是由细胞因子与其对应的受体相结合产生的。如IFNα与I型IFN受体相结合。募集于接种位点的肿瘤特异性T淋巴细胞有两种类型，其一是在荷瘤机体接受过刺激（primed）的记忆细胞。其二是处女T细胞。这两种细胞活化后产生肿瘤特异性记忆T细胞，重新参与体液循环，再一次接触TAAs时，例如在转移灶处，就可以通过介导细胞因子和趋化因子的产生而诱导局部抗肿瘤免疫反应，新产生的这些因子又可进一步募集（recruit）其它T细胞，最终消灭肿瘤，淋巴结引流区的处女T细胞也可被激活（primed），随接种次数的增加抗肿瘤反应性T细胞的数量也不断增加。
ATV-NDV临床应用的另一个重要方面就是由于修饰剂（病毒或细菌）的存在对机体反应状态的逆转。病毒或细菌感染过中，炎症原因子的释放干扰了免疫耐受和自身免疫性疾病的诱导（21）。因此，利用病毒（如NDV）或细菌（如BCG（22））修饰自体肿瘤细胞在逆转机体无反应状态（免疫耐受）方面似乎是非常合理的，这种无反应状态受到肿瘤特异性T细胞的冲击。
三、ATV-NDV临床应用安全性
下面我们总结一下NDV ulster感染人肿瘤细胞的特点。该病毒可以在人的肿瘤细胞中大量复制，这一特点可以采用流式细胞技术做定量分析。例如：NDV ulster感染人黑色素瘤细胞后，用抗HN单抗染色显示，细胞表面荧光强度随NDV感染剂量的增强，呈剂量依赖性漂移，用200Gy r-射线辐射肿瘤细胞可以证实病毒在肿瘤细胞中的复制是非宿主细胞增殖依赖性的。因为r-射线处理并不影响病毒在宿主细胞中的复制，所以r-射线处理可以在感染肿瘤细胞之前或之后进行，或者在患者使用前进行。至于这种治疗手段的安全性问题需要特别指出的是：NDV ulster基因组不与宿主细胞DNA整合，该病毒不能在人正常细胞中复制，对人没有感染性。另外，感染人肿瘤细胞后新产生的病毒颗粒没有感染能力，至少有三种方法可以证明这一点（23）。如果人们对应用活病毒还心存疑虑的话，紫外线灭活是一个很好的办法，因为NDV很容易被紫外线灭活而不破坏其细胞结合能力和CTL刺激活性（31）。
四、NDV感染肿瘤细胞介导粘附分子、改善抗原呈递、诱导细胞因子和趋化因子产生和T细胞共刺激活性
（一）介导粘附分子，改善抗原呈递
本节将着重讨论ATV-NDV的功效、作用机制和相关的文献综述。1979年日本学者Kobayashi用鼠Friend病毒感染大鼠肿瘤细胞进行肿瘤免疫治疗的实验(24)，为了解释其免疫治疗效果他首次提出了完整肿瘤细胞的"异种化"概念，他认为实验中观察到肿瘤消退现象是由于T细胞介导的对外来病毒抗原识别的辅助效应所致。在此文中Kobayashi还报告了许多移植瘤实验的新发现，即经过辐射处理灭活的完整肿瘤细胞（inactived but live）的免疫原性要比细胞裂解物和细胞膜的免疫原性强。德国科学家Schirremacher教授在混合淋巴--肿瘤细胞培养（MLTC）实验中，也证实了这一点。他们的实验证实，灭能但存活的完整肿瘤细胞在产生肿瘤特异性CTL的应答方面具有极其重要的作用而细胞裂解物的免疫原性极低（25）。在L10豚鼠肝癌模型中，他们观察到，肿瘤细胞疫苗中肿瘤细胞的活力在形成局部炎症应答和抗转移治疗效果方面具有与上述同等的重要性（22）。进而，在一系列动物肿瘤模型免疫/保护实验中证实，同种同基因肿瘤细胞系（allogeneic）或同源同基因细胞系（syngeneic）间的低交叉反应性表明其肿瘤识别和系统保护性免疫的高特异性，抗高转移鼠淋巴瘤亚系Esb的肿瘤特异性CTL识别I类MHC（Kd）限制性肿瘤抗原表位而不与其亲代低转移淋巴瘤细胞系Eb发生交叉反应（26、27）。
利用NDV修饰、r-辐射处理的Esb活肿瘤细胞疫苗，术后免疫接种发生微转移同源同基因小鼠DBA/2实验表明，接种这样的疫苗能对这些小鼠产生明显和长时期的保护效果（18、19）。所有以上这些实验和观察结果就构成了病毒修饰自体肿瘤活细胞疫苗治疗概念的基础。
在早期的Esb肿瘤模型ASI研究中，德国学者观察到用低剂量NDV ulster修饰比用高剂量NDV ulster修饰能获得最佳的治疗效果（18），类似的结果在大鼠Friend病毒修饰的实验中也观察到了（28），利用不同剂量NDV修饰的Esb肿瘤细胞的大容量体外MLTC研究揭示了，低剂量病毒修饰在增强肿瘤细胞特异性CTL应答方面，具有最佳的生物学功能（29）。紧接着德国学者在有限稀释分析中发现NDV对肿瘤细胞的感染引起CTL的前体细胞增加3倍；检验单个CTL克隆的特异性发现，所有克隆都是肿瘤特异性的，而没有一个克隆是识别病毒抗原的（29）。另外，病毒修饰在增强体外免疫应答是非常迅速的，而这是建立在病毒特异性T辅助细胞（TH）诱导基础上的"异种化"假设所不能解释的，也就是从那时候开始（1988年）由德国学者Schirremacher教授等提出了由NDV感染介导的T细胞共刺激活性概念。
现在我们知道，T细胞共刺激依赖于肿瘤细胞表面某些粘附分子作为配体与相应的T细胞表面上的受体之间的粘附作用。例如CD80和CD86与T细胞表面上的CD28相互作用介导了一个共刺激信号（也称为CD28途径）；LFA-3与CD2相互作用介导了另一个共刺激信号（T细胞受体复合物相关途径）。图2 说明了德国科学家早期的NDV介导的T细胞共刺激活性假说。在提供这一假说的最新实验证据以前，我们先来讨论直接引起免疫原性和T细胞刺激能力改变的NDV感染后肿瘤细胞表面的分子变化。NDV感染肿瘤细胞后引入了一个新的细胞表面粘附分子--神经氨酸酶（HN），它增强肿瘤细胞表面对淋巴细胞的粘附作用，通过各种病毒灭活方法检验证实，NDV增强肿瘤细胞免疫原性的能力与其肿瘤细胞表面的结合能力密切相关（30）。进一步实验证实，HN-c-DNA鼠成纤维细胞的稳定转染株比对照新感染株能结合更多的淋巴细胞。当抗原特异性T细胞与特异抗原肽共孵育并允许其与各自的同一个细胞上的I类MHC呈递的抗原肽相互作用时，表达HN的细胞增强了抗原呈递能力（31）。另一个重要发现就是，NDV诱导的干扰素（IFNs）在抗肿瘤CTL的应答方面具有重要的作用（32）。如果将α、β干扰素的中和抗体加入MLTC的培养液中，发现CTL活性明显减小，说明I类干扰素在抗原特异性CTL应答方面具有重要的辅助功能。在基因重组干扰素面世以前，NDV一直是用来生产不同细胞类型干扰素的最常用的病毒，但是，干扰素不仅仅是NDV感染肿瘤细胞所产生的唯一可溶性介质。
（二）诱导细胞因子和趋化因子产生
业已证明，在肿瘤细胞或宿主细胞感染NDV后可产生的细胞因子、趋化因子和其它基因产物达12种以上，其中：细胞因子有IFNα、β，TNFα，IL-1，IL-6；趋化因子有RANTES、IP-10 ；其它基因产物如：HSP、ACTH endorphin,iNos,EPA/TIMP，NFkB等。在本文所涉及的T细胞活化和肿瘤细胞疫苗的主动免疫方面起重要作用NDV诱导介质是TANTES和IP-10，它们对单核细胞和T淋巴细胞在ATV-NDV接种位点部位募集发挥着重要作用。这一结论可以用白细胞募集的海绵基质测定实验所证实（33）。也可以从癌症患者免疫接种后增强的迟发型超敏反应观察到（34）。
因为α-干扰素和β-干扰素在T细胞介导的抗肿瘤免疫应答方面的重要作用过去一直被忽视，这里需要着重指出I型干扰素（IFNs）在CTL应答和保护性抗肿瘤免疫方面具有协同作用。一个最显著的例证就是I型IFN受体基因敲除小鼠，由于受体的缺失导致CD8 T细胞（即细胞免疫中的杀伤性T细胞）降低10倍，这一结果以及前面所述的抗体阻断实验都表明，T细胞活化的共刺激信号不仅通过象CD28这样的粘附分子产生，也通过象CTL上IFN-R这样的细胞因子受体介导产生，这些信号在T细胞的功能活化和扩增等方面都具有重要作用。NDV能诱导小鼠巨噬细胞产生α-干扰素和β-干扰素，在体外的MLTC-CTL培养实验和体内的保护性抗肿瘤免疫检验中都证明了IFNα和IFNβ具有协同作用（36）。同样，病毒诱导的干扰素也增强T辅助细胞的旁观者效应（35）或者增强对同族CD4T细胞的辅助以及CD8T细胞应答。在过继性抗肿瘤免疫治疗中，也可看到抗肿瘤免疫致敏T细胞和IFNα/β的协同效应。
（三）诱导T细胞共刺激活性
NDV感染肿瘤细胞后诱导T细胞共刺激活性。NDV不仅可以诱导鼠CD4和CD8 T淋巴细胞的应答，也可以诱导人CD4和CD8 T淋巴细胞的应答。关于CD8T细胞的应答我们在前面已经提到过，NDV来源的HNcDNA转染至I类MHC-肽抗原呈递细胞中，可以刺激鼠抗原特异性CTL前体细胞的能力增强8倍；至于CD4T细胞的应答，我们也发现，当与亚适剂量的抗-CD3刺激物混合后，NDV可诱导共刺激活性。对于人T细胞来说，一个有趣的发现是，有些来自于病人的黑色素瘤特异性CD4T辅助细胞克隆，它们不能被自体黑色素瘤刺激细胞刺激，只有以抗CD28抗体形式存在的共刺激信号存在时才被活化（37）。如果没有共刺激信号的存在，这些T细胞在与肿瘤细胞相互作用后，不仅不增殖，不产生IL-2，而且变成无反应状态（无能），之后再遇共刺激信号也无应答。在德国癌症研究中心设计的新检验系统中可以看到，NDV感染自体黑色素瘤细胞的共刺激效应是：增殖后的T细胞应答、IL-2的产生和阻止无反应状态的诱导。
在图2 所示的模型中，集中反映了病毒修饰的肿瘤细胞和应答T细胞间相互作用的分子。这个模型表明了一种机制。即每个细胞引入103-104个功能HN分子后，瘤苗就能发挥最大的生物学效应。副粘液病毒的HN分子在病毒的表面通过二硫键形成二聚体和四聚体，每一个复合物代表了一个起吸附作用位点的分子丛和神经氨酸酶活性。表达于肿瘤细胞或抗原呈递细胞表面的HN分子，要么以膜整合的形式，要么以非融合病毒子的形式起粘附分子的作用，这是因为HN具有与神经节苷酯上的唾液酸-寡糖相结合的结构域，另外一个结构域所表达的神经氨酸酶活性可以导致唾液酸酯解（受体破坏活性），这是病毒除吸附的正常机制，细胞表面负电荷的移去可以减少细胞间的电脉冲，增强细胞的相互作用（30）。
最近有报道指出，共刺激信号使T细胞的活化域值大大降低（从每细胞8000个T细胞激发受体降至1500个），使T细胞对抗原的刺激更敏感（38）。可以想象，在T细胞受体激发的连续动力学过程中，邻近HN分子与细胞表面受体的结合和破坏功能，可以降低T细胞的活化域值从而产生共刺激效应。
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