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一、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头：1ml、200μl、20μl 3、匀浆管：5ml 4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个 5、EP管：1.5ml、0.2ml 6、量筒：50ml、250ml、500ml 7、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 8、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水 9、铝制饭盒：4个 10、锡泊纸：一卷 11、三角烧瓶：带盖，稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等） 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用。 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC） 三、试剂配制： 1、DEPC水：吸出1mlDEPC和2ml无水乙醇放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇+无RNA酶水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压） 3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制： 1、电泳缓冲液： Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml？ pH8.0 蒸溜水 1000ml 5×TBE （贮存液） 再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液 2、上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 6×缓冲液，4℃保存 五、琼脂糖凝胶的配制： 1、1.0%： 1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭（EB）2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。 2、1.5%: 同上，将琼脂糖的量改为1.5g 六、需购置的Rt-PCR材料： （生工. Tel. 2236106.） Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00 dNTP: 1支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer) RNasin（RNA 酶）: 1支 110 —— -20℃ DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies —— 4℃ Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威 （1543. 994. 697. 515. 377. 231） 七、引物合成 1、内参照： GAPDH 正义：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′ 反义：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′ β-actin 正义：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′ 反义：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′ 2、par-4: 正义：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′ 反义：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′ 3、退火温度计算 2（A+T）+4（G+C） 正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃） 4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好 5、引物稀释： 加DEPC水量为（μl） = ? nmol / OD × 管上所标OD数×100 是为10p mol / μl 浓度的引物溶液 八、PCR产物电泳 先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酚兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。 九、几个注意点： 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？ 2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提前，打开离心机预冷。 TRIzol法抽提总RNA 组织100mg ↓ 加1mlTRIzol ↓ 匀浆（要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓ 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓ 4℃，离心12000g，15分钟 ↓ 转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中 ↓ 加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟 ↓ 4℃，离心12000g，10分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml ↓ 4℃离心7500g，5分钟 ↓ 弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥） ↓ 溶于DEPC水中至20μl（10μl-20μl） （可在55-60℃水中，<10分钟助溶） 注： 1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解 2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月（甚至可一年以上） 3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年 两步法RT-PCR （第一步：逆转录反应） 试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23μl(11.5μl) Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl （稀释10倍后用） ↓ 混匀，离心，70℃ 5min ↓ 立即冰水浴，稍离心 ↓ 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1× dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U 总体积40μl（20μl） ↓ 混匀，离心，42℃ 60min ↓ 95℃ 10min（破坏MLV） ↓ 4℃保存 两步法RT-PCR （第二步：PCR反应） 总体积20μl(50μl) 试剂 浓度 体积 终浓度 Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1× MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM 上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol 下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol cDNA模板 X  (1-10μl) DEPC水 20μl—4.3μl—X Taq酶 2.5U/μl 0.3μl (1μl) 2.5U/μl ↓ 混匀 ↓ 97℃，5分钟 ↓ 立即冰水浴 ↓ 混匀 ↓ 95℃ 5分 预变性 94℃ 30秒 变性 X℃ 40秒 退火 72℃ 30秒 延伸 72℃ 7分 终末延伸 28-36循环，4℃保温 三、电泳： 加1-10μl PCR产物+溴芬兰（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。 注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。DNTP勿反复冻融。 |
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