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话说青霉素一：被埋没的偶然发现 1928年9月的一天早晨，在英国伦敦圣玛丽医学院担任细菌学讲师的弗莱明(A.Fleming)像往常一样来到了实验室。在实验室里一排架子上，整齐地排列着很多玻璃培养皿，里面分别培养着各种有毒的细菌。弗莱明正在寻找一种能够制服它们，或把它们变成无毒菌的方法。其中有一种在显微镜下看起来像葡萄状，存在很广泛，能够使伤口感染化脓的葡萄球菌。弗莱明试验了各种药剂，力图找到一种能杀它的理想药品，但是一直没有成功。 弗莱明来到架子前，逐个检查着培养皿中细菌的变化。当他拿起靠近窗户的一只培养皿的时候，他皱起了眉头，自言自语道：“唉，怎么搞的，竟然变成了这个样子！”。原来，这只贴有葡萄球菌标签的培养皿里的培养基发了霉，长出一团青色的霉斑。
他立即决定，把青霉菌进行培养。几天后，青霉菌明显繁殖起来。于是，弗莱明用一根湿线蘸上葡萄球菌，放到青霉菌的培养皿中，几小时后，葡萄球菌全部死亡。接着，他分别把带有白喉菌、肺炎菌、链球菌、炭疽菌的线放进去，这些细菌也很快死亡。但是放入带有伤寒菌和大肠杆菌的线时，这两种细菌照样繁殖。 为了试验青霉菌对葡萄球菌的杀灭能力有多大，弗莱明把青霉菌培养液加水稀释，先是一倍、两倍……最后以八百倍水稀释，结果它对葡萄球菌和肺炎菌的杀灭能力仍然存在。这是当时人类发现的最强有力的一种杀菌物质了。 可是，这种青霉菌液对动物是否有害呢？弗莱明小心地把它注射进了兔子的血管，然后紧张地观察他们的反应，结果发现兔子安然无恙，没有任何异常反应。这证明这种青霉菌液体没有毒性。 通常，在培养微生物时发生这种情况并不奇怪，这叫污染了杂菌。因为在我们周围的空气中漂浮着各种各样的微生物，如细菌、真菌、酵母，甚至于病毒等，即使经过过滤、消毒、灭菌，仍然不会全部去除，有时在接种时还会有的落在培养基上，培养后长成菌落。按照常规做法，如果不影响实验结果，可以忽略；如果有影响，要重新进行实验。 弗来明没有按常规进行处理，他仔细观察、验证，才有了青霉素的发现。弗莱明发现青霉素虽然代有偶然性，但如果不具备严禁的科学态度和追求探索精神也不会有发现，同样前人的经验、知识的积累也给他以莫大的启示。因此任何重大发现都是必然的偶然，这种偶然只留给那些有心人。 1929年６月，弗莱明把他的发现写成论文发表。他把这种青霉菌分泌的杀菌物质称为青霉素。 由于青霉素具有抑制细菌的能力，对动物无害，他建议用这种青霉菌培养液作局部外敷来治疗溃疡一类的皮肤感染。但是因为青霉素在培养物中的含量太少，没有办法大量制备供给使用。还由于当时人们正热衷于磺胺药物研究，把希望寄托在正在风靡的磺胺药物上。更重要的是1932年克鲁德布科(Clutterbuck)和1935年瑞德(Reid)根据弗莱明的发现，对青霉菌的培养物也进行了研究，并提取了青霉素，他们发现在水溶液里青霉素性质不稳定，在室温下放置时间长了就会破坏，失去杀菌作用。因此，认为不适合用作抗感染性疾病的药物，也不值得进行深入地化学与生物学的研究。因此，人们就这样把青霉素放弃了。 话说青霉素二：重新燃起的希望 人类二十世纪的上半叶多灾多难，战争频发，疾病流行，因为无药救治造成大量死亡。1939年第二次世界大战爆发，造成大量伤员，在战场上没有死，但因为感染无法控制，许多伤病员在痛苦的煎熬中死去，为拯救伤员性命，急需大量的抗感染药物进行救治。 于是人们又想到既然青霉素可以杀死葡萄球菌，就有可能杀死能使人致病的细菌。在牛津大学主持病理研究工作的澳大利亚病理学家佛罗理(H.W.Flory)和德国的生物化学家钱恩(E.B.Chian)，仔细阅读了弗莱明关于青霉素的论文，对这种能杀灭多种病菌的物质产生了浓厚的兴趣。但是他们知道，要提取出这种物质，需要各方面科学家的共同努力。他邀请了一些生物学家、生物化学家和病理学家，组成了一个联合实验组。这之中，德国生物化学家钱恩是他最主要的得力助手。
在佛罗理的领导下，联合实验组开展了紧张地研制工作。微生物学家们每天要配制几十吨培养液，把它们灌入一个个培养瓶中，在里面接种青霉菌菌种，等它充分繁殖后，再装进大罐里，送到钱恩那里进行提炼。 提炼工作繁重而艰难，一大罐培养液只能提炼出针尖大小的一点点青霉素。经过几个月的辛勤工作，钱恩提取出了一小匙青霉素。把它溶解在水中，用来杀灭葡萄球菌，效果很好。即使把它稀释二百万倍，仍然具有杀灭能力。 联合实验组选择了50只小白鼠来进行试验；把每只都注射了同样数量，足以致死的链球菌，然后给其中25只再注射青霉素，另外25只不注射。实验结果是不注射青霉素的小白鼠全部死亡，而注射的只有一只死去。 之后，他们开始了更努力的提取工作，终于获得了能救活一个病人所需的青霉素。医生第一次用青霉素救治了一位患败血症的危重病人，使当时无法治疗的败血症病人恢复了健康，这引起巨大的震动。于是青霉素一时成了家喻户晓的比黄金还要贵重的救命药物。 社会需求是推动科学技术前进的动力。只要是有益于人类的发现都不会被埋没。 话说青霉素三：希望变为现实 这时佛罗理清醒地意识到，为使青霉素能广泛地用于临床治疗，满足战争的需要，必须改进方法和设备，进行大规模生产。但这对联合实验组来说非常困难。当时伦敦正遭受德国飞机的频繁轰炸，要进行大规模生产也很不安全。1941年6月，佛罗理不顾钱恩的反对，带着青霉素样品来到不受战火影响的美国。他马上与美国的科学家们开始合作。经过共同努力，终于研究成以玉米汁为培养基，在24℃的温度下进行发酵的方法和设备，提炼出的青霉素，纯度和产量有了大幅度提高。在1943年实现了青霉素的工业化生产。从而很快开始了在临床上的应用。
青霉素制备最早还采用过固体表面培养法，就是使用麸皮、豆饼粉、玉米粉等固体物与水混合制成的固体培养基经过加热灭菌，冷却后与青霉菌菌种液体混合，放到浅盘里，再将盛有发酵物的浅盘摆放在室内的架子上，保持室内温度和湿度，并经常的翻动，进行发酵。发酵结束后，用水将产生的青霉素由固体培养基中浸提出来，制成干粉。这个生产过程与过去农村使用原始的制曲发酵生产酱油醋类似。使用这样的非常原始的生产方法虽然可以生产出青霉素产品，但存在许多问题。 为了获得足够量的青霉素，需要大量的培养基和培养室，占用的厂房非常大，这也使得温度和湿度很难控制；工人在又热又潮的培养室里，劳动强度非常大，十分辛苦。更重要的是在发酵过程中，为了通气，培养基是暴露在空气中，空气中的各种微生物会造成大量污染，无法做到纯种发酵，使得每一次的发酵结果都不相同，很难控制发酵过程，生产的产品的质量也无法保障。象这样的问题还有很多，因此，当时利用表面培养法生产青霉素的水平很低，发酵酵价只有40多单位/毫升，提取收率只有20%，产品纯度为20%，而且成本很高。按现在对医药产品质量要求，这样的产品很难作为药物使用。 因此，迫使人们探索新的生产方法。1942年液体深层发酵法研究成功。所谓液体深层发酵是指与固体表面培养相反，使用液体培养基在固定的容器内发酵。液体培养基是相对于固体培养基而言，液体培养基中水的含量达到80-90%，而固体培养基的固体物占60-70%，水占30-40%。液体培养基中可能是完全溶解的营养物质，也可以含有一定数量的固体物营养物。
因为青霉菌生长和产生青霉素需要氧气，发酵过程必需通入大量的空气满足它们的需要。而通入普通的空气是不行的，因为空气中存在大量的微生物，进入发酵液中会大量繁殖，造成污染，甚至喧宾夺主，使发酵遭到破坏。因此，必须彻底地清除通入的空气中的所有微生物。一般是通过加压升温，冷却除水，多次无菌过滤等方法来实现。这就需要一套制备无菌空气的设备和工艺。 另外，空气中的氧气在水中的溶解速度和量十分有限，为了满足青霉菌生长和产生青霉素的需要，要加快氧的溶解速度和提高发酵液中的氧浓度。为解决这个问题，除了加大通气量外，更重要的是将通入的空气气泡打碎、变小。对于同一体积的空气来说，只有气泡越小，空气与液体的接触面积越大，氧气在发酵液中的溶解速度越快，才可满足菌体的需要。为了实现这一目的，首先要将进入发酵罐的空气尽可能的分散成较小的气泡，然后再通过搅拌打成更小的气泡，这就需要精益求精的不断完善设计，改造设备。 搅拌在发酵过程中还有改善物质和热量传递的作用，使发酵物料混合均匀，防止局部温度过高，提高加热和冷却效率等。但是，搅拌不当，也有负面作用，比如打断菌丝，伤及细胞，影响细胞的正常代谢和青霉素的合成。因此，为了提高搅拌效率，降低负面影响，对搅拌器的形状、大小、位置、个数，以及产生的混合方式都有严格要求。影响混合效率的还有发酵罐的形状、径高比，挡板的形状、数量、设置位置、形态等等。这就涉及发酵罐和辅助设备的设计和加工等一系列的工程设备问题。 对于任何一种微生物来说，它们生长和合成产物时都需要一个适宜的温度范围，就象我们人一样温度高了、低了都不行。我们可以通过增减衣服，开空调、暖气来解决。对于微生物我们没有办法给它们穿衣服，但可以采用类似开空调、暖气的方法解决。就是在发酵罐上加上用于冷却和加热的夹套和螺旋管，通过通入冷水或热水进行冷却或加热，维持发酵温度。 另外，为了保证纯种发酵，也就是只保证能够产生青霉素的一种青霉菌生长，而不允许其他微生物生长、污染，在接种产生青霉素的青霉菌之前，要对使用的发酵罐及附带的设备和培养基进行灭菌、把其中存在的所有微生物全部杀死，防止将杂菌带入发酵系统。通常对培养基和发酵设备进行消毒灭菌都是使用高温灭菌法，即通入高温高压蒸汽进行消毒。灭菌之后还需要进行冷却，使温度降到适合微生物生长。微生物在生长、代谢旺盛时会产生大量发酵热，使温度升高，这时需要对发酵系统进行冷却，保持适宜的发酵温度；发酵后期，微生物生长缓慢，发酵热产生减少，甚至停止，进行产物合成时又需要维持适当温度，这时又需要进行适当加热保温。为了在不同发酵阶段保持适宜的温度。所以必须有加热和冷却装置和控制系统。 发酵结束，产生的青霉素还在发酵液中，必须进行分离。首先要进行过滤，将发酵液中的固体物质，比如菌体和没有消耗掉的固体营养物组分除去，将滤液用酸调成酸性，使青霉素成为青霉素酸，然后用有机溶剂乙酸丁酯进行萃取，将青霉素萃取到有机溶剂中，达到分离的目的，经脱色，再用碱性水从何含有青霉素的有机溶剂反萃取出来，使青霉素变成盐，重新溶到水中，经过浓缩，进行结晶，经过干燥，就可以得到青霉素产品。 早期青霉素生产的过滤设备
为了满足青霉素发酵和提取的这些条件，就必须解决与之有关的技术，设备和工艺问题。为此人们根据对青霉素发酵过程认识的不断深入，不断地研究和发展了可通入无菌空气、利用夹套和套管通入冷、热水控制温度的密封搅拌式发酵罐，以及配套的其他设备，如空气压缩、过滤、灭菌设备，以及相应的生产工艺和技术。使青霉素的生产从上个世纪四十年代初的发酵效价每毫升200单位，提取收率75%，产品纯度为60%的水平的基础上不断提高。也使发酵所需的厂房占地面积、劳强度、能源消耗、原材料、成本等大大降低，为青霉素在临床上的大量使用奠定了基础。 话说青霉素四：精益求精 虽然青霉素可以工业生产了，但这种生产水平与现在的生产水平无法相比。现在青霉素工业生产使用的发酵罐最大的可达300立方米，生产过程全部由计算机控制，青霉素的发酵水平达到每毫升发酵液7-8万单位，实验性的发酵水平达到每毫升发酵液10万单位，从发酵液中提取出青霉素，制成产品的收率为90-95%，产品纯度99.9%以上。仅就青霉素的发酵水平的变化图就可以看到，几乎是每十年青霉素的发酵酵价增加一倍。
青霉素产业化到现在也就是半个多世纪，而这半个多世纪里，科学技术的发展突飞猛进，极大地推/带动了青霉素工业的发展。前三十年的生产水平的提高主要依赖于微生物学、遗传学、生物化学和发酵工程学的发展。首先是生产菌种发生了巨大变化，人们在自然界广泛收集产生青霉素的微生物菌种，不断地进行对比、选择，筛选到生产水平更高的产青霉素菌种。然后，根据经典遗传学的方法，采用各种物理、化学诱变和无性杂交手段，对菌种进行改造，使菌种的产青霉素水平不断提高；另外，根据菌种的生理特性和青霉素合成代谢的特点不断改善培养基成分，投其所好，使青霉素的发酵水平逐步上升。 随着人们对青霉菌的生理、生化特性研究的不断深入，对青霉素在细胞内的合成过程也了解的越来越多，人们根据这些特点采取了各种有针对性的措施，限制其对产生青霉素不利的因素，充分发挥、调动有利因素，不断优化发酵和提取的条件，在发酵设备、工艺、技术上采取相应措施，是上个世纪七、八十年代以前青霉素发酵和生产水平不断地大幅度提高的主要原因。 比如发现葡萄糖虽然是菌种生长和合成青霉素必须的碳源，但是过多的葡萄糖会产生抑制作用，特别是对青霉素的产生不利。因此在发酵过程中随着葡萄糖不断的被菌体利用消耗而采取了不断的流加补充葡萄糖的方法，保持葡萄糖浓度处于低水平，既能够满足青霉菌生长和青霉素合成的需要，又不会产生不利影响，从而使菌体生长和青霉素的合成水平大幅度提高。 对青霉素的化学结构的研究发现，青霉素是由两部分，即青霉素母核和侧链组成。由不同的菌种产生的青霉素虽然有差别，但母核是相同的，差别只在侧链上，比如青霉素G的侧链是苯乙酸，而青霉素V的侧链是苯氧乙酸。对青霉素在细胞内合成过程的研究发现，构成青霉素G和V不可缺少的侧链前体在菌体细胞内合成速度比较缓慢，成为合成青霉素的瓶颈，因此人们想到，在发酵时添加必须的侧链苯乙酸或苯氧乙酸是否可以提高青霉素的合成速度和产量呢？实际的研究结果证明，确实如此。于是人们又研究什麽时候加，加多少，怎样加等等问题，随着侧链添加工艺的不断改进和完善，青霉素的发酵水平不断的上升。 对在青霉素合成途径研究时发现，与赖氨酸的合成过程有关系，赖氨酸生物合成的一个中间体α-氨基己二酸参与青霉素合成。而赖氨酸合成过程中，如果赖氨酸合成多了时，赖氨酸会回过头来对其本身的合成过程的第一个酶高柠檬酸合成酶的产生反馈抑制作用，这就限制了α-氨基己二酸的生成，从而间接地抑制青霉素的合成。如果在青霉素发酵过程中加入α-氨基己二酸，可减少赖氨酸的抑制作用，也就提高青霉素的产量。这一发现又为提高青霉素的发酵水平开辟了一个新的途径。 详细研究青霉素发酵过程中，温度对菌体生长、发酵水平的影响时发现，总体上菌体生长的最适温度为30℃，青霉素合成的最适温度为20℃。根据计算机模拟对发酵最适温度的计算得出结论，青霉素发酵的最适温度是在最初的5小时维持30℃，在较高的温度下可加快细胞成长，缩短发酵开始时细胞适应新环境的时间；随后发酵温度降低到25℃，发酵35小时，控制菌丝生长和代谢水平；再降低发酵温度到20℃，发酵85小时，可以促进青霉素的合成；最后发酵温度回升到25℃继续发酵40小时，然后结束发酵，放罐。最后提高发酵温度的目的在于促进发酵产物青霉素从细胞内释放到发酵液中。采用这种变温发酵，使发酵过程的细胞生长和产物合成阶段均处于最适温度条件下，其青霉素的产量要比以前的25℃恒温发酵的产量高14.7％。 人们就是通过这样的一点一滴的详细研究的积累，不断加深对菌种和青霉素合成过程的的认识，不断改进、完善发酵和提取的工艺、技术和设备，到上个世纪八十年代青霉素的发酵达到了每毫升发酵液六、七万单位的水平。 话说青霉素五：好风凭借力，送你上青天 近十多年来，基因工程和代谢工程的发展，为改造菌种，提高青霉素产量提供了强有力的手段。因为现在青霉素在细胞内的合成途径和关键点，以及青霉素合成途径与其他代谢途径的关系已经研究的十分清楚，因此，人们可以采用基因缺失的办法将能够消耗合成青霉素原料和干扰青霉素合成的代谢旁路的关键基因“关掉”，或将这个“控制阀门”关小，提高合成青霉素原料的利用率，减少了副产物的形成，进一步提高了青霉素的产量。或者是用基因工程方法将控制青霉素合成途径的基因，和合成青霉素途径中的关键基因再转移到青霉素生产菌中，使其数量增加，这相当于将控制基因阀门开大，使合成青霉素的途径更顺畅，也可以大大的提高青霉素的产量。这就是利用基因工程的方法有目的的改造青霉素的代谢合成途径，因此称为代谢工程。 前面我们提到菌体生长和青霉素合成都需要大量的氧，因此在发酵过程中提供充足的氧是青霉素发酵的关键。但是在大生产中，因为设备条件的限制，利用提高搅拌速度，加大通气量和提高发酵罐的压力的方法提高氧的溶解速度和浓度都是有限的。为了突破这种限制，人们想到了血红蛋白，因为它是动物体内携带氧的分子，一个血红蛋白分子可以携带四个氧原子，具有富集氧的作用。因此利用基因工程方法，将血红蛋白基因导入生产青霉素的菌种中，在它的细胞内合成一定数量的血红蛋白，可以起到富集氧的作用，达到提高青霉素的产量的目的。通过这样的一些列改造，获得的工程菌的生产能力大幅度提高，再配合发酵工艺的改进，青霉素发酵酵价可以达到每毫升近10万单位，产生的青霉素可以直接从发酵液中结晶出来。
在这半个多世纪里，青霉素的生产水平的不断地提高，达到现在这种水平，完全是在相关科学和技术的进步的带领和推动下实现的，特别是近十多年来，生物技术的进步和发展为青霉素生产水平的提高起到巨大的推动作用。另外，青霉素产业的发展和提高离不开工程、技术、工艺和设备的不断发展和完善，它们相辅相成，缺一不可。这也是千千万万的科学技术工作者辛勤努力的结晶。 话说青霉素六：继往开来 青霉素在治疗疾病上的巨大成功，极大的震撼和鼓舞了微生物学家和药物学家，使人们认识到微生物可能是一个巨大的新药宝库，为寻找新的药物开辟了新的思路和途径。人们怀着如同淘金和寻宝一样的心情开始在微生物中寻找新的类似于青霉素的物质。1944年瓦克斯曼(Waksman)从灰色链霉菌中发现了能够治疗结核病的链霉素。结核病一直困饶着人类，是使人极度恐慌的传染病，链霉素的发现为人类征服结核病带来了希望，同时也开辟了利用放线菌生产抗生素的途径。 随后在微生物中发现了许多具有杀灭和抑制其他微生物发育和代谢，有的还可抑制肿瘤细胞的发育和代谢的生物活性物质，现在人们将之统称为抗生素，具有抗微生物作用的抗生素又称为抗菌素。上个世纪的60-80年代是抗生素研究发展的高峰年代，到目前为止从微生物中发现的抗生素有近8000多种，在工业上生产并在临床上应用的抗生素有近100种。因此形成了一个庞大的抗生素工业产业体系。 青霉素的产业化，是由传统发酵进入现代发酵工业的转折点，标志一个新的产业部门，现代发酵工业的诞生。为了青霉素的工业化生产，不断提高生产水平，人们进行了大量的微生物生理、生化、代谢研究，找到了提高青霉素发酵水平的方法和条件，为保证这些方法和条件在工业上实现，人们又研究开发了大量新的工程、设备、技术和工艺并应用于青霉素生产，进一步促进了青霉素工业的发展。在青霉素工业发展的同时，带动了其他发酵产品的研究开发，并将青霉素生产的经验，设备、技术、工艺扩展到其他发酵产品上，促进了其他发酵产业的发展，逐渐形成了抗生素、氨基酸、有机酸、酶制剂、有机溶剂、维生素、食品，以及近年发展的多糖和核酸等工业系统，形成了完整发酵工业体系。它的生产总值，在我国达到整个国民经济生产总值的4-6%，而在发达国家达到10%。 伴随着青霉素产业的诞生和发展，解决青霉素和现代发酵产业技术、工艺、工程和设备的研究和发展遇到的基础理论和应用基础理论问题，一个新的学科，发酵工程学也随之诞生了，它现在已经成为生物技术中的发酵工程和生物化学工程的主要部分，为生物技术产业的发展做出了巨大贡献。 话说青霉素七：青霉素不灵了？ 青霉素之所以能够杀细菌，达到治病的目的，那是因为青霉素能够抑制或破坏细菌细胞壁的形成。这正如把一只小兔子的皮剥掉，小兔子就不能活一样。细菌细胞壁被破坏，细菌就不能够繁殖，从而达到杀菌治病的效果。 在上个世纪的五十年代，也就是青霉素开始大量在临床上使用时，一个病人每一次注射青霉素只需要20万单位，而到了九十年代，一个病人每一次注射的青霉素需要80-100万单位，青霉素用量几乎增加了近5倍。为什麽在不到半个世纪里，病人需要注射的青霉素用量增加了近5倍，是不是如人们所说的现在的青霉素质量不如从前了呢！不是的。现在生产的青霉素质量不仅不比从前生产的青霉素质量差，反而还有大幅度的提高。其主要原因是由于人们长期、大量使用青霉素，特别是不科学的大量滥用青霉素，如低剂量长期使用，使许多致病菌对青霉素产生了耐药性，不得不增加青霉素的用量，以保证治疗效果。 还有些致病菌不仅能够耐药，而且还产生了破坏青霉素的能力，能够将青霉素的母核破坏，使其丧失杀菌活性。这样青霉素就不能把它杀死。 为了解决出现的这个问题，人们又开始了新的征程。 话说青霉素八：魔高一尺，道高一丈 在研究青霉素的化学结构与药效关系中，发现青霉素母核是由一个四元环与一个五元环并在一起所组成的分子活性部分，它是青霉素抗菌活性的关键部分，如果四元环被破坏而打开，青霉素就失去了抗菌活性；另一部分是与之连接的侧链。研究发现改变侧链的结构，可以增加母核的稳定性，增加耐受致病菌破坏的能力。同时还可以扩大抗菌谱，增加耐酸性，使之可以口服，在一定程度上也可以降低过敏性。因此，通过对青霉素的侧链结构改造，可以达到提高青霉素药效和治疗作用的目的，具有巨大的临床应用价值。 在以前人们是利用化学方法将用发酵产生的青霉素的侧链‘切下’来，获得母核，然后再经化学方法给母核接上一个新的侧链，得到的是经过改造的‘半合成青霉素’。致病菌对经过改装的青霉素的破坏和耐受能力降低，容易被杀死。过去病人打一针普通青霉素要80-100万单位，而现在打半合成青霉素，如氨苄青霉素，羟氨苄青霉素，只需要20-40万单位，就可以达到同样的治疗效果，甚至更好。 但是，用化学方法生产青霉素母核很困难，需要很繁杂的低温化学反应，一不小心，可能就会失败，拿不到产品，而且使用的试剂昂贵，生产的青霉素母核成本很高，阻碍了半合成青霉素的发展。 上个世纪的五十年代末期，人们在微生物中发现了一种能够将青霉素的侧链‘拆下来’得到青霉素母核的一种酶，就给它起名叫做青霉素酰化酶，但当时并没有引起人们的注意。直到上个世纪的七十年代，半合成青霉素的发展需要大量的青霉素母核，而使用化学方法生产又遇到许多困难时，才想到青霉素酰化酶，开始进行大量研究。 最早发现的青霉素酰化酶是由大肠杆菌细胞产生，酶是存在于细胞内，因此称为胞内酶。可以直接使用含青霉素酰化酶的大肠杆菌细胞作为酶源，用于催化青霉素的水解反应，将侧链切掉，获得母核。后来发现其它一些细菌，比如巨大芽孢杆菌，产生的青霉素酰化酶是在细胞外的发酵液里，人们称之为胞外酶，因为产量高，比较容易分离得到而受到人们的重视。 但是，不论是胞内还是胞外的青霉素酰化酶在工业上使用都有许多缺点。比如使用细胞作为酶源时，在使用过程中细胞会破裂，由细胞释放出来的许许多多细胞内的东西会跑到反应液中产生污染，增加产物分离的负担，影响产品质量；即使细胞不破裂，因为大肠杆菌细胞很小，从反应液中除去细胞也比较麻烦；使用酶时，因酶是溶解在水里的，它催化反应完了也需除去，但分离有一定困难，容易污染产物；另外，细胞和酶催化反应结束后，并未完全丧失催化能力，往往还可以再使用，但在溶液中的细胞和酶很难分离出来再使用。费了很大力气生产的细胞或酶只使用了一次，就丢掉了，十分可惜，也是浪费。 为了解决上述这些问题，自上个世纪七十年代发展了固定化技术，将产胞内青霉素酰化酶的细胞用适当的材料包埋形成小珠，制成固定化细胞，或将青霉素酰化酶结合在特殊的高分子材料上，制备成固定化酶。因为它们颗粒大，解决了难以回收的问题，而且固定化后酶的稳定性大幅度提高，可以长期反复使用。这样可以减少细胞和酶的生产成本，不必每一次都要生产酶或细胞，生产足够量的酶或细胞，进行固定化后就可以长期使用。 将固定化酶或固定化细胞装在底部有细的滤网的搅拌罐式反应器中，加入10%的青霉素溶液，保持温度35-40℃左右，在缓慢的搅动下，通过pH自动控制仪流加碱液，保持反应液的pH在8.0-8.5，进行反应，几个小时后，反应结束，打开反应罐底的阀门，将反应液放出，而固定化酶或细胞保留在反应罐内，再加入青霉素溶液，重复上述过程，就可以进行下一批反应。这样可以连续的使用固定化酶或细胞。将反应液加入酸，将pH调到弱酸性，用有机溶剂将反应产生的侧链提取出去，留下的反应液经适当浓缩后，产生的青霉素母核即可结晶出来。 也可以将固定化酶或固定化细胞装在柱式反应器中，将青霉素溶液从柱反应器的一端以较高的流速进入，从另一端流出到储罐中，通过pH自动控制仪流加碱液，保持反应液的pH在8.0-8.5，反应液通过循环泵反复通过柱式反应器，就可以将青霉素裂解，结束后利用上述方法获得青霉素母核。 利用这样的设备可以进行大规模的批式或连续生产，容易实现自动化和连续化，反应结束后，因为酶是固体的，很容易与反应液分开，酶和细胞不会污染产物；酶也可以反复再用，这使得青霉素母核的生产变得比较轻松，可以大幅度的降低生产成本，提高产品质量。为青霉素母核的生产开辟了一种全新的生产方法，克服了化学方法的缺点，解决了因此带来的环境污染等问题。 过去，青霉素酰化酶都是由从自然界筛选到得到的大肠杆菌或巨大芽孢杆菌生产的，产酶量比较低，虽然通过诱变和选育得到的菌种生产能力有所提高，但依然生产能力有限，现在人们利用转基因的方法，将青霉素酰化酶基因转入原来的生产菌，或其它的菌种，使青霉素酰化酶的基因数量增加，可以大幅度的提高青霉素酰化酶的产量，再经固定化，能够更好的满足大规模的生产要求。 有了青霉素母核，再接上一个新的侧链，就成为半合成青霉素。在上个世纪九十年代以前，都是使用化学法合成。但早在七十年代就发现青霉素酰化酶不仅可以催化青霉素水解产生母核，也可以催化母核与新的侧链反应合成半合成青霉素。其与生产青霉素母核的反应条件不同，生产母核的反应是在弱碱性条件，而合成反应是在弱酸性和有新的侧链的衍生物存在下进行。现在利用青霉素酰化酶催化合成氨苄青霉素已经获得成功，但还不能象化学合成方法那样可以用于合成各种半合成青霉素。 半合成青霉素，从上个世纪六、七十年代的第一代产品已发展到现在的第四代，我国医院大量使用的氨苄青霉素，羟氨苄青霉素是第三代产品，是现在临床上的主力药物。在国外，如果发烧病人到医院看病，大夫先前给病人注射一针氨苄青霉素，然后去检查。因为这种药抗菌谱广，过敏反应低，疗效高，是医生信得过的药物。 与原来的青霉素相比，因为侧链改变了，原来对青霉素有抗性的致病菌对它有些“面生”不怎麽认得，于是被稀里糊涂地杀死了。如果使用老的青霉素，需要打80-100万单位，而打氨苄青霉素，只需要20万单位。那麽如果以前生产1000吨老青霉素（比如青霉素G钾盐）能够满足市场需要，现在只要生产200吨氨苄青霉素就可以了。其经济效益和社会效益就可想而知了。 话说青霉素九：青霉素的孪生兄弟 很早以前就发现，在青霉菌发酵生产青霉素时，发酵液中多多少少的还同时有与青霉素类似的另一种抗生素，头孢霉素。它们在结构上有许多相似之处，均由类似的母核与侧链组成。不同之处不仅侧链结构有差别，母核也有差别。青霉素母核上的五元环在头孢霉素母核上为六元环。猛看上去它们很相象，是一对孪生兄弟。 在青霉菌发酵时，在合成的开始阶段青霉素和头孢霉素有共同的前体，不久出现分支，在分支点上，有一个重要的“调节阀门”，叫做扩环酶，将青霉素母核的五元环扩大成六元环，再走下去合成的是头孢霉素；如果不扩环，直接走下去进入了青霉素合成。一般情况下，扩环酶量很少，因此，在青霉素发酵液中头孢霉素的量也很少。 现在人们想到，能不能对青霉素和头孢霉素合成途径中的分路阀门进行调节，让它合成青霉素就全都是青霉素，而不产生头孢霉素；让它合成头孢霉素，就全部合成头孢霉素，不就可以进一步提高它们的产量吗。 现在利用基因工程方法就可以做到。将扩环酶基因克隆到青霉素生产菌里，加大扩环酶基因数量，使它产生更多的扩环酶，相当于将“调节阀门”打开。同时利用基因工程方法，将临近扩环酶下游的，流向青霉素合成的基因消除或“关闭”，使代谢合成青霉素的流向，全部流向头孢霉素的合成，就将原来生产青霉素的菌种改造成为生产头孢霉素的菌种。同样，如果将青霉素生产菌的扩环酶基因消除，相当于将合成头孢霉素的合成流关闭，菌种在发酵过程中就不会再有头孢霉素的产生，既可进一步提高青霉素的产量。这也就是现在所说的，利用基因工程方法改变代谢途径的代谢工程。 利用发酵法生产的头孢霉素C在临床上使用的很少，因为它的疗效不是很令人满意。现在发酵法生产的头孢霉素主要是作为原料，将侧链切掉，获得头孢霉素母核(7-ACA)，然后再接上一个新的侧链，生产半合成头孢霉素。头孢霉素母核的生产可以使用化学方法，也可以使用酶工程方法。因为与青霉素的侧链结构不同，头孢霉素C的侧链是氨基己酸，使用青霉素酰化酶不能够将其切下，必须使用另外两种酶：D-氨基氧化酶和GL-酰化酶联合作用将侧链切下来，才能得到头孢霉素母核，这种方法已经在我国研究成功。 依据这个思路，人们将D- 氨基酸氧化酶和GL-酰化酶两个基因同时克隆到能够生产头孢霉素C的菌种中，使用这个工程菌进行发酵，可以在发酵液中积累头孢霉素C的母核7-ACA。但是，因为在D-氨基酸氧化酶催化氧化侧链时会产生过氧化氢，它是个强氧化剂，会使细胞和酶受到破坏，因此，产量不高。现在人们又在考虑将能够破坏过氧化氢的过氧化氢酶基因也克隆到上述工程菌中，有可能解决这个问题。 另外，不久前从微生物中找到了头孢霉素C酰化酶，它可以直接将头孢霉素C的侧链切下，获得头孢霉素母核。然后使用化学或酶法合成半合成头孢霉素。 现在，为了生产半合成头孢霉素，人们利用化学法进行扩环，将青霉素G变成头孢霉素，因为侧链与青霉素G相同，使用青霉素酰化酶将侧链切下来，生产一种称为7-ADCA的头孢霉素母核，然后用于合成半合成头孢霉素。这种方法已经用在工业上大量生产氨苄头孢霉素和羟氨苄头孢霉素，并在医院里大量使用。由于它们比半合成青霉素更能够耐受胃酸，因此可以口服，使用更方便。它的过敏反应低，抗菌谱广，病菌的耐药性小，在临床上得到广泛应用。 话说青霉素十：功德无量 人们为了战胜疾病，围绕着青霉素开展了长达半个多世纪的坚持不懈的努力，随着科学、技术的进步，特别是生物技术的广泛应用，使青霉素的生产达到前所未有的水平。 青霉素的发现开创了抗生素时代，青霉素及其类似物在临床上的广泛应用，挽救了成千上万人的生命，使人类与疾病的斗争进入了一个全新的世纪，使人类平均寿命从45岁增加到60岁，为增进人类的健康做出了巨大贡献， 青霉素的产业化带动了现代发酵工业的诞生，形成了一个全新的产业，为人类带来了丰富多彩的产品，提高了人类的生活质量。 这一切，与青霉素的发现者弗莱明及为使青霉素工业化生产和利用奠定基础的佛罗理和钱恩有着密切关系。为了表彰题目为人类做出的巨大贡献，这三位科学家共同获得了1945年的诺贝尔生理和医学奖。他们为人类文明和社会进步做出不可磨灭的贡献，我们后人将永远纪念他们。 亚历山大. 弗莱明（Alexander. Fleming）（1881-1955） 恩斯特-保罗斯-钱恩（Ernst. Boris. Chain）（1906-1979） |
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