Native PAGE,Non-reducing Denaturing PAGE, SDS-PAGE

现在在做蛋白的分离鉴定，在这收集总结。

根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理. 

1、还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离.一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样. 

2、带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象.100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺,并在室温保温30min. 

3、非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1％SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用.

Non-reduced Denaturing：非还原变性，除了上样缓冲液中无还原剂外，其余等同通常的SDS-PAGE。
Native：非变性。天然状态下上样，无SDS,无还原剂，不煮样品。

SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 

DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近。但DTT价格略高一些。DTT有两个巯基集团，巯基乙醇只有一个巯基集团。
就因上述原因使得1个蛋白做非还原电泳和还原电泳所跑的迁移率不同。

100度加热的目的就是蛋白变性，并且和sds进行充分的结合，是为了破坏蛋白质的高级结构.煮过的蛋白跑胶就不会受到它本身高级结构的影响,只和大小相关.不煮的话,跑胶的速率就与很多其他因素相关,特别是高级结构.不加热可以电泳但是效果不好。

确定多聚体蛋白大小可以用非还原PAGE胶，样品加上5xSDS Buffer(不含DTT、巯基乙醇)(1:4比例）煮沸3-5分钟，其余与SDS-PAGE相同。

还原型和非还原型的区别就在于样品缓冲液，前者含有一定量的还原剂，常用的为DTT或巯基乙醇。

巯基乙醇作用：一是防止蛋白质或酶等分子中的SH-基氧化成S-S，二是某些酶反应中维持体系的还原环境。及有可能该蛋白质含有S-S，在巯基乙醇作用下还原为SH-。断开二硫。