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兰科植物种类繁多，是有花植物中最大的家族之一，仅次于菊科。其中，具有一定观赏价值的兰科植物统称兰花。 在世界各地育种家的不懈努力下，兰花已跻身于世界主流观赏花卉的行列。目前，花育种仍以传统的杂交育种为主，但随着现代生物技术的发展，基于细胞水平、分子水平的新育种技术不断涌现。作为生物技术育种手段之一的多倍体育种具有诸多其他育种手段不可替代的优势，并且越来越受到们的重视。 一、兰花多倍体育种的意义 1、提高兰花的观赏价值 花朵是兰花的主要观赏部位，改良花朵的外部形态是兰花育种工作的主要目标。而染色体组加倍的植物往往表现出器官的“巨大性”。通过多倍体诱导的方法可以培育出花朵巨大，花色浓郁，质地厚重的兰花新品种。同时，多倍体育种可以使花植株粗壮、叶片宽阔，从而进一步提高花的整体观赏价值。 2、克服远缘杂种不育性 在兰花的杂交育种工作中，为了获得更多优良性状，通常会使用远缘杂交的方法来培育新品种。但由于两个亲本染色体数目不同等原因导致杂种F1细胞在减数分裂时染色体无法联会。因此，远缘杂交的后代往往是不育的。通过对杂种F1进行染色体组加倍，使其细胞在减数分裂时能够正常联会，从而克服远缘杂种的不育性。 3、利用多倍体作为遗传媒介 染色体加倍可以克服杂种不育性，将多倍体作为遗传育种的媒介已在育种工作中普遍应用。例如，提高花的抗病性、抗寒性等是兰花育种工作的重要目标之一。在育种工作中，需要将原生种的优良抗性基因导入栽培种。利用诱导多倍体的方法克服杂种后代不育性，并结合杂交、回交等方法可培育出带有优良抗性基因的新品种。 二、多倍体诱导技术在兰花育种中的研究进展 1、兰花多倍体育种现状 目前，石斛兰、大花蕙兰、蝴蝶兰、文心兰等的多倍体育种已有涉及，并获得了一定的成果。李涵等使用秋水仙素诱导二倍体齿瓣石斛，成功获得四倍体植株；张莹等使用秋水仙素诱导二倍体石斛杂交品种Den.utopia‘Messenger’×Den.whit-erabbit‘Sakurahime’获得四倍体植株；杨丽娟等使用秋水仙素诱导二倍体大花蕙兰品种野红宝石冶获得四倍体植株；崔广荣等使用秋水仙素诱导蝴蝶兰二倍体品种Phalaenopsis Tsuei Foa Lady获得成功；崔广荣等使用秋水仙素诱导二倍体文心兰品种“金西”获得成功。而目前卡特兰、万代兰、拖鞋兰等的多倍体育种仍未见报道。 兰花多倍体育种尚处于起步阶段，虽然在一些种类中已成功诱导出多倍体植株，但仍存在嵌合体较多、花期延迟、死亡率高、遗传不稳定等诸多问题需要解决。多数种类的兰花仍未培育出多倍体植株，有待进一步研究。 2、兰花染色体加倍技术研究进展 2.1 自然界中的染色体加倍 多倍体是高等植物染色体进化的显著特征。多倍体植物在自然界中是普遍存在的，兰科植物也不例外。天然多倍体的主要来源包括染色体未减半的配子融合、体细胞染色体加倍及多精受精3种方式。在兰花育种或栽培过程中可通过筛选、鉴定的方法获得天然的多倍体植株。然而，天然多倍体发生频率很低，远远不能满足花遗传育种的需要。为了得到更多的花多倍体植株，人们开始寻求工诱导多倍体的方法。 2.2 物理方法诱导染色体组加倍 在早期的植物多倍体育种研究中多采用物理方法进行染色体组加倍。其中包括低温处理、高温处理、辐射诱导等。例如，低温处理可诱导小麦花粉的自然加倍；高温处理可诱导杨树的二倍体花粉；用γ射线照射早春苗木或穗条的冬芽或略膨芽可获得四倍体植株。 物理方法诱导多倍体总体诱导率不高，且在兰花多倍体育种中未见相关报道。在后期的多倍体育种研究中，以化学诱导为主。 2.3 化学药剂诱导染色体组加倍 化学试剂诱导法以秋水仙素等化学药剂处理植株细胞分裂旺盛的部位，达到染色体加倍的目的。化学药剂诱导法是目前使用最为广泛，也是诱导率最高的方法。 2.3.1 化学药剂的种类 秋水仙素是目前花多倍体育种应用最为广泛的化学诱变剂。在细胞分裂过程中，秋水仙素通过抑制细胞纺锤体微管的形成，迫使细胞有丝分裂中断，从而得到染色体组数加倍的细胞。对这些染色体加倍的细胞或组织进行继代及分化培养后得到多倍体植株。在兰花多倍体育种中，秋水仙素处理温度一般在18~20℃，处理浓度通常在0.001%~5%之间，视兰花的具体种类及处理方法而定。秋水仙素的浓度及处理时间较难控制，处理浓度过大，时间过长，容易对组织造成伤害；处理浓度过低，时间过短，则不能达到染色体加倍的目的。 由于秋水仙素对植物微管的亲和性较低，诱导染色体加倍时需要较高的浓度，因此对植物材料的伤害较大。同时，秋水仙素易形成嵌合体且价格较昂贵；易引起染色体重排或丢失，基因突变，再生植株生长异常等问题。因此，一些新的化学诱变剂被相继发现，例如，氨氟乐灵（Pronamide）、氨磺乐灵（Oryzalin）、甲酰胺草磷（Amiprophosemethyl，APM）和戊炔草胺（Propyzamide）等。这些药剂对植物微管蛋白的亲和性高，且多倍体诱导率高，同时对动物微管蛋白的亲和性低，因此，这是一类安全高效的植物染色体加倍剂。甲基胺草磷是一种含磷酰胺结构的除草剂，实验证明，在植物细胞的悬浮培养中，甲基胺草磷能够完全解聚微管的排列，导致高水平的中期分裂相，并且使中期分裂指数显著增长。戊炔草胺也有类似的作用，但不能完全组织微管聚合，因此作用较弱。氨磺乐灵和氨氟乐灵的诱导率也较秋水仙素高。但由于这两种药剂对植物组织培养阶段的愈伤组织存在较强的毒害作用，严重抑制愈伤组织和再生植株的生长，因此不适合于组织培养结合使用。而甲基胺草磷和戊炔草胺是对愈伤组织诱导比较有效的药剂。在诱导饲用甜菜珠的染色体加倍的实验中，这4种药剂和秋水仙碱相比，甲基胺草磷更加有效，其所用的浓度比秋水仙碱浓度低了近100倍左右。 2.3.2 化学诱变常用的处理材料 由于秋水仙素等化学诱变剂仅对有丝分裂时期的细胞有效，因此植物多倍体育种的处理材料通常可选取种子、顶芽、侧芽以及组织培养中的愈伤组织、不定芽等分裂旺盛的器官或组织。由于科植物形态特征及繁殖方式的限制，对花进行多倍体育种通常采用化学诱变结合组织培养方式，即在组织培养阶段对原球茎或不定芽进行处理，来达到染色体加倍的目的。 2.3.3 处理方法 对花组织培养阶段原球茎或不定芽进行化学诱变一般采用浸泡法和共同培养法2种方法。浸泡法处理时，将原球茎或不定芽切下，置于一定浓度的化学诱变剂中浸泡一段时间后取出，并继代培养。李涵等使用浓度为0.03%秋水仙素溶液浸泡齿瓣石斛丛生芽24小时，死亡率为10%，变异率达60%；杨丽娟等使用浓度为3%的秋水仙素溶液处理大花蕙兰原球茎48h，死亡率为8.9%，变异率为23.3%。共同培养法处理时，将花原球茎或丛生芽接种到添加有一定浓度的化学诱变剂的继代培养基上进行培养。杨丽娟等使用共培法处理大花蕙兰原球茎，结果表明，在附加3%秋水仙素的培养基中处理15d效果最好，诱导率达30%；邓樱等使用共培法处理兰属耶黄心素爷，结果表明，在秋水仙素浓度为0.005%的培养基中处理3d效果最好，诱导率为16.7%。一般认为共同培养法诱导率略高于浸泡法。 2.4 细胞融合加倍法 随着细胞融合技术及原生质体培养技术的发展，也可以通过体细胞融合的方法来实现染色体加倍。细胞融合主要分为化学融合和物理融合。其中，常用的化学融合剂为聚乙二醇（PEG），PEG结合高钙离子诱导法是目前常用的方法，适量添加二甲基亚砜、伴刀豆蛋白A、及链霉蛋白等可提高诱导率；物理方法主要使用电融合法，通过施加高压电脉冲，使原生质膜可逆性击穿，从而达到细胞融合的目的。 目前由于技术条件等原因的限制，利用细胞融合进行染色体加倍仍未广泛应用。但随着相关技术的发展，此类方法将逐渐受到重视。 2.3 兰花多倍体植株鉴定技术研究进展 2.3.1 观察外形特征 多倍体植株往往表现出器官的“巨大性”，因此通过观察植株的外形特征可以做出初步判断。多倍体兰花植株通常株型矮壮，整体植株较大；叶片较二倍体短而宽阔，叶色浓绿；同时，多倍体兰花植株生长较慢。 2.3.2 观察气孔保卫细胞 通过观察植株叶片的下表皮气孔形态，可以发现多倍体植株叶片单位面积内气孔数量减少，且气孔直径明显较二倍体大。张莹等观察了石斛兰多倍体的气孔，发现气孔的长和宽比二倍体增加了21.44%和28.30%，保卫细胞的长和宽增加了30.88%和24.98%。同时，多倍体植株保卫细胞内叶绿体较大，叶绿素含量增多。 2.3.3 染色体组数鉴定 取初步筛选出的变异株茎尖，进行染色后在显微镜下观察染色体数目。在石斛兰、大花蕙兰等的多倍体染色体数目观察中发现有一小部分为四倍体，其染色体组数目为4组；大多数植株为嵌合体，以及部分非整倍体。嵌合体及非整倍体通常表现为茎扭曲、叶片卷曲、变形等。 三、兰花多倍体育种中存在的问题 1、嵌合体现象 在兰花多倍体育种中往往出现大量的嵌合体，加之花生长速度缓慢以及形态特征等的限制，对花嵌合体进行纯化极为困难。在嵌合体植株生长过程中，四倍体细胞处于劣势而被逐渐淘汰，导致育种失败。因此，如何减少嵌合体数量将是今后兰花多倍体育种的重要内容之一。 2、多倍体植株生长缓慢 多倍体植株由于细胞染色体数目多，细胞分裂速度慢等原因，通常表现出生长缓慢的生理特性。同时，多倍体植株存在组织培养增殖率低，花期延迟等问题。 3、诱变剂浓度较难掌握 目前，兰花多倍体育种多采用秋水仙素等化学药剂进行诱变。这些化学药剂对植物组织具有较强的毒害作用，在使用时，若浓度控制不当会抑制不定芽的分化，甚至导致植株死亡。 四、展望 多倍体育种作为兰花新品种选育的重要育种方法，应用前景广阔。通过花多倍体育种与传统杂交育种相结合，能够克服传统育种过程中遇到的诸多问题；与现代生物技术相结合，有望从分子水平上探索倍性遗传机制以及多倍体遗传稳定性等问题。此外，随着原生质体培养技术、细胞融合技术等新技术的不断发展成熟，新的兰花多倍体育种方式也将逐渐受到重视。
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