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一、相对定量的原理： PCR反应的基本原理请参考分子克隆第三版P611 因此你每次实验带走的Ct值是最后的ΔΔCT，看到这里不知道你是否明白相对定量的原理, 不明白没关系，但是你必须记住：上述结论是基于内参基因和目的基因的扩增效率必须一致。 二、如何保证内参基因和目的基因扩增效率一致 2.1 理论上来说，应该使用目的基因和内参基因扩增至少5个一般7个浓度梯度稀释的同一模板，如果两者的扩增效率相等，那么以目的基因浓度对ΔCT作图，该直线的斜率理论值应该为0，实际值应该无限接近于0； 2.2 我相信2.1这个实验能够真正会计算的人不会太多，那么对于我们这种菜鸟怎么办，ZOCSunshine告诉你，你可以直接看扩增曲线，如果目的基因和内参基因的扩增曲线在指数扩增区间（一般的软件都会对曲线进行线性化处理）两条曲线相互平行，就可以了，不用追究太多； 2.3 怎么办？ 第一，如果两者的扩增效率不相等，最笨的办法就是用绝对定量的办法，耗时耗力还不一定做得对，推荐高手使用； 第二，更换引物和试剂保证两者基本一致； 第三，试了太多也没办法，那就将阈值设定在两者扩增效率一致的位置，即该位置两者切线斜率相等。 三、做完一个实验你应该关注什么？ 很多的童鞋做完实验后，考走一个Ct值就万事大吉了，其实你做的远远不够，那么做完实验我们应该关注什么？ 第一，最重要的，溶解曲线，必须保证你的溶解曲线是单峰曲线，有任何一个小峰都不行，如果出现在主峰之前，考虑为引物二聚体，如果出现在主峰之后，考虑非特异性扩增，如果曲线完全没有主峰，考虑引物污染； 第二，扩增曲线，首先必须保证你的syber green信号从0开始，如果不从0开始，考虑为基因组DNA污染，如果你的引物为跨内含子设计，影响不会太大。ROX信号必须保持平稳，如果出现大幅度波动，考虑反应体系蒸发，该孔结果不可信。 第三，内参基因的Ct值，可能这个大家关注的很少，但是它也很重要，一般情况下，各个样品管之间的Ct值之间的差距不应该太大，因为如果各个样品管之间差距太大，表明你的模板量就不一样，那么扩增效率也会不一样，从而降低结果的可信度。 总结，说了这么多总结起来就两句话，第一，必须保证目的基因和内参基因扩增效率一致，第二，注意溶解曲线和扩增曲线的质控。 如果文章对你有用，别忘了关注我们哦。 |
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