今天我们邀请冰糖来介绍 lentiCRISPR v2 应用指南。
酶切之后不需要 CIP 脱磷也不会自连。
参考文献: Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPRscreening. Sanjana NE, ShalemO, Zhang F. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4. doi:10.1038/nmeth.3047. 10.1038/nmeth.3047 PubMed 25075903 gDNA 设计方法和原则请查看「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」。请加颜值担当菌菌,微信号:biotalk。注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南一》。 对于 lentiCRISPR v2 克隆,其合成的 oligo 末端和 pX330 不同,请注意设计。 举个例子说明(千万注意 oligo 的方向) 1.Backbone 的酶切体系与文章「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」一样,不脱磷处理参考图 1 中的操作,脱磷处理参考图 2 中的操作。 2.Oligo 的退火条件也与文章「CRISPR/Cas9 系统操作指南一」一样。 注意:如果载体不脱磷,oligo 不需要磷酸化;载体脱磷参考图 2(FengZhang 提供的 protocol,设计脱磷,可以参考),oligo 就需要加磷处理。 图 1
包装病毒使用的包装体系如下(for 100 mm dish, 6x106 293T)
转染条件:用细胞转染试剂 lipofiter。DNA:lipofiter=1 μg:2.5 μL 收集 48 h 和 72 h 病毒上清,待用。 此处病毒包装的 protocol 没有列出,如果想看,请加颜值担当菌菌,微信号:biotalk。注明 protocol 就会给到你《CRISPR/Cas9 系统操作指南一》。
如果抗体好用,直接用 Dot blot 也很快, 通量高。 文章来源:文章由冰糖授权转载 |
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