前言 lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布的一个慢病毒载体,cas9和sgRNA表达框在同一个载体上,而且Cas9的C端带有FLAG融合标签,载体包含Puromycin抗性基因,适合建系。验证sgRNA活性的时候也适合瞬转;包装成慢病毒适合常规细胞系的建系,构建非常方便。 lentiCRISPR v2应用指南 克隆gDNA使用BsmBI位点,载体可以切出一个~1.9 kb的filler片段,便于confirm酶切成功并利于载体回收; BsmBI的位点是 ,酶切之后不需要CIP脱磷也不会自连! Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB或者Immunostaining EFS promoter被优化的小而强,极大提高了慢病毒包装的效率 载体带有Puromycin抗性,可以富集转染/感染成功的细胞。 如何设计gDNA gDNA设计方法和原则:(主要参考以下链接:https://www./52961/) gRNA设计:通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到PAM序列:NGG(N代表任意核苷酸),然后找到其紧邻的上游20 nt即可 (如上图)。 目的位置的选择:我们绝大部分时候的目的是完全KO一个基因,其原理是利用移码突变(CRISPR/Cas系统诱导产生indel)。所以我们一般选择距离起始密码子ATG下游200bp范围内的exon区域。另外,通常一个基因往往会转录成2个以上的isoforms,所以请选择尽量靠近5’端的公共部分,保证每个isoform都会成功移码突变。 通常情况下,为了便于下游KO mutants的鉴定,我们往往可以作如上设计:即Cas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过,且附近至少100 bp内酶切位点唯一。 为了减少Off-Target效应,请把设计好的Target放在括号中的网址里去做预测,尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验(http://crispr. )。 20 nt确定之后,请按照如上图所示合成两条配对的普通oligo即可。请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点G。 对于lentiCRISPR v2克隆,其合成的oligo末端和pX330不同,请注意设计; 举个例子说明(克隆小白千万注意oligo的方向) Backbone的酶切体系参考下方步骤(说明:不脱磷处理参考黑框,脱磷参考红框内操作) Oligo的退火条件也参考下方步骤(说明:如果载体不脱磷,oligo不需要磷酸化;载体脱磷参考红框内操作,oligo就需要加磷处理!!!(红色框内是FengZhang提供的protocol,设计脱磷,仅作为参考) 病毒包装的protocol非常多,小编只列了基本的信息。后续会出详细写慢病毒包装步骤的干货! 转染 (2 μg plasmid/60 mm dish,细胞密度60-80%)【v2=lentiCRISPR v2,下同】 感染 (1-5 ml病毒上清)【v2=lentiCRISPR v2,下同】 单克隆的挑取---单克隆可以有限稀释到96-well plate(~30 cells/plate)(293T、HeLa、MEF等细胞系推荐使用)。如果编辑效率50%,推荐分两块plate即可,最终拿到20-30个单克隆一般可以得到成功KO的细胞系;或者铺到100 mm dish里,一周后挑取单克隆(这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如,但是挑取的单克隆偶尔不纯,有时需要重新亚克隆)。 单克隆的鉴定---根据设计,推荐使用酶切鉴定的方法(见设计部分),通量高;如果抗体比较好用,推荐使用WB检测蛋白,这种方法最彻底;最末一种方法就是直接测序鉴定,该种方法费时费力费钱,建议设计时尽量避开。 有限稀释法(悬浮细胞适用此法)---50-100 cells 均匀分到96-well plate 单克隆挑取法 KO 单克隆的鉴定 直接测序或者酶切鉴定 抽取genomic DNA,然后PCR测序或者或者酶切鉴定 测序 酶切鉴定(设计的时候很有技巧) WB鉴定 如果抗体好用,直接用dot blot或者免疫荧光染色可以,速度快,通量高。当然普通WB也可以。 |
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