一 载体简要说明 1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点,载体可以切出1.9kb的filter,便于确定载体酶切成功,并且利于胶回收。 2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷,也不会自连。 3在cas9的C端有FLAG,可以WB或Immunostaining来检测。 4 EFS被优化的小而强,方便慢病毒的包装,极大的提高了慢病毒包装的效率。 5 优化的内部核糖体插入位点P2A,可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。 二 gDNA设计说明 对于lentiCRISPR
V2克隆,其合成的oligo末端与px330不同如下图所示: 具体举例如下:一定注意oligo的方向,载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链,否则编辑无效,且5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。 将引物稀释 100uM 后,再 10 倍稀释 退火 50ul 体系 引物 20ul(上下游各 10ul)、 水 25ul、 NEB buffer 2(10*)5ul 95℃,5min。然后关闭 PCR 仪,自然降温 40min。
LentiCRISPR V2 载体酶切 200ul体系: BsmBI 2ul; 10*buffer 20ul; 质粒 10ul(2ug) 水 16ul
55℃,酶切 2 小时 胶回收 连接 2*solutionI 5ul 退火引物 4.5ul 线性化载体 0.5ul 16℃连接过夜,转化挑菌送测序。 |
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