细胞总蛋白提取方法

一、溶液配制

见Western Blot方法部分

二、方法

(一)组织蛋白提取

70 mg组织，500 μl裂解液匀浆，再200 μl冲洗管转入1.5ml ependorf 管，冰放置30min，10000 rpm ×30min，取上清。

(二)细胞蛋白提取

1. 细胞收取

1) 细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞

2) 弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。

3) 加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。

4) 待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃

5) 弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×3min，4℃

6) 重复PBS清洗一次，弃上清，-80℃冻存待裂解

2. 蛋白提取

1) 向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS、

1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)，混匀

后冰上放置40mins

2) 10,000rpm×15min，4℃

3) 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）

(三)测定蛋白浓度

使用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。原理如下：蛋白质分子均具有-NH3+基团，当在蛋白标准液或样品加入棕红色的考马斯亮蓝显色剂后，蛋白-NH3+可与考马斯亮蓝染料上的阴离子结合，溶液转变为蓝色，在相应波长测定每管吸光度可以计算出每管的蛋白含量。具体操作步骤为：

1) 取离心管，按照如下方式进行加样：

	空白管	标准管	测定管
蒸馏水(μl)	10 or 5
0.563g/L标准液(μl)		10 or 5
样品(μl)			10 or 5
考马斯亮蓝显色剂(ml)	0.6	0.6	0.6

2) 混匀，室温静置10min，选择1cm光径，波长595nm，蒸馏水调零，测各管OD值，计算蛋白浓度。

3) 浓度计算（按如下公式）：

例：

	mg/ml		mg/ml
SKOV3	2.134	pcDNA3.1(-)-ssRKIP4	1.687
pcDNA3.1(-)	1.585	pcDNA3.1(+)-asRKIP34	1.091
pcDNA3.1(+)	2.117	pcDNA3.1(+)-asRKIP35	0.692
pcDNA3.1(-)-ssRKIP12	2.084	pcDNA3.1(+)-asRKIP37	1.757

(四)将蛋白浓度均一化为1.5 mg/ml

	原蛋白液（μl）	裂解液（μl）	终浓度
SKOV3	106	44	1.5μg/μl
pcDNA3.1(-)	142	8
pcDNA3.1(+)	106	44
pcDNA3.1(-)-ssRKIP12	108	42
pcDNA3.1(-)-ssRKIP4	134	16
pcDNA3.1(+)-asRKIP37	128	22

(五)取150μl蛋白样品（均一化后）+50μl4×SDS-PAGE Loading Buffer，沸水浴5min，冰浴，-20℃保存。（加入SDS-PAGE Loading Buffer后终浓度为1.125μg/μl）

Note：自组织中提取胞浆蛋白时，因组织来源不同，所取组织︰裂解液的比例不同，见下表。，

组织来源	称取组织（mg）	裂解液体积（μl）	提取后蛋白浓度（mg/μl）
心肌（含结缔组织多）	140	700	1.5~3
心肌（含结缔组织少）	70	700	2~4
肾	70	700	2~4
血管	60	500	2~4
肝	70	700	2~4
肺	70	700	2~4