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????? PKCI-1/HINT1表达质粒的构建及其对黑素瘤A375细胞凋亡及自噬影响的初步研究倪娜娜 温斯健 张韡 姜祎群 孙建方 作者单位：中国医学科学院 北京协和医学院 皮肤病研究所病理科 DOI：10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.05.012 《中华皮肤科杂志》，2016，49（5）：348-352 目 的 构建人PKCI-1/HINT1基因的真核表达质粒，研究其在人黑素瘤A375细胞株中的表达并检测其对A375细胞凋亡及自噬的影响。 方 法 以人黑素瘤细胞A375的总RNA为模板，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增PKCI-1/HINT1基因序列，将PKCI-1/HINT1基因克隆到真核表达载体PCDNA3.1（+）中，构建PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1重组体。将PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1表达载体瞬时转染黑素瘤A375细胞，RT-PCR及Western印迹检测PKCI-1/HINT1在细胞内的表达，并以PCDNA3.1（+）空载体转染细胞作为相应对照组。噻唑蓝（MTT）检测PKCI-1/HINT1转染后细胞的增殖变化，Hoechest 33258染色检测细胞凋亡，采用绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3（GFP-LC3）标记结合激光共聚焦显微镜法检测PKCI-1/HINT1对细胞自噬的的影响，并通过Western印迹检测PKCI-1/HINT1对细胞内caspase 3及自噬相关蛋白beclin1蛋白表达的影响。 结 果 PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1真核表达载体经酶切及测序鉴定构建成功，并能够在细胞内有效表达。MTT检测发现PKCI-1/HINT1能够明显抑制A375细胞的增殖，与PCDNA3.1（+）对照组相比，在48 h、72 h及96 h PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1组活细胞数分别减少17.0%，25.6%、29.4%，差异有统计学意义（均P < 0.05）。hoechest="" 33258染色显示pkci-1/hint1可促进a375细胞内凋亡小体形成。激光共聚焦显微镜发现pkci-1/hint1的过表达可使a375细胞内gfp-lc3b的点状聚集增加。western印迹发现，pkci-1/hint1可促进细胞内caspase=""> 结 论 成功构建真核表达载体PCDNA3.1（+）-PKCI-1/HINT1并在细胞内有效表达PKCI-1/HINT1。PKCI-1/HINT1的高表达可以抑制A375细胞增殖，促进其凋亡，同时可引发A375细胞的自噬过程。 |
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