【文峰聊CNS】肿瘤转移的“带头大哥”

【文峰聊CNS】肿瘤转移的“带头大哥”

大部分人类癌症中，我们并不知道到底是由何种细胞来“启动”肿瘤的转移。今天给大家解读的是2016年12月发表在Nature上的一篇Article，题为《Targeting metastasis-initiating cells through the fatty acidreceptor CD36》，即通过脂肪酸受体CD36靶向转移起始细胞。文章描述了在人口腔癌的CD44高表达（CD44^bright）细胞中，存在一类特殊细胞亚群，它们并不过表达“间质”基因，而是具有慢周期性（slow-cycling），并能表达大量的脂肪酸受体CD36和脂质代谢基因，具有起始转移的能力。软脂酸或者高脂饮食能特异性增强CD36⁺转移起始细胞的转移能力，且这种增强依赖于CD36。在人口腔癌的免疫缺陷或免疫健全原位小鼠模型中，用中和抗体阻断CD36，能够起到几乎完全抑制转移的作用，且无副作用。在临床上，多种类型癌症中若存在CD36+转移起始细胞提示预后不良，而抑制CD36能够减少转移，至少在人黑色素瘤来源和乳腺癌来源的肿瘤中能够发挥作用。总的来说，研究结果表明，转移起始细胞能够促进癌症转移，并依赖于膳食脂质。

 关于肿瘤细胞如何从原始病变部位分离出来发生远处转移的机制还相当不清楚。大部分实体肿瘤中常见促转移机制可能包括上皮间质转化（EMT）、与间质成分或肿瘤激活的间质细胞相互作用等等。某些肿瘤能够分泌促进转移的外泌体，这些外泌体中包含有蛋白质、mRNA、microRNA，能够建立一个远位促转移“利基”（pro-metastasis niche）。然而，在这些原始肿瘤起始细胞中是否存在一类“转移起始细胞”亚群并不清楚。

一、 LRCs表达脂质代谢基因

        作者用一种亲脂荧光染料脉冲染色来源于人口腔癌（口腔恶性肿瘤的总称）的细胞系或病人来源细胞（PDCs，patient-derived cells），这种亲脂荧光染料能非特异性地与膜结合，其染色强度随细胞分裂而减少。将这些染色后的细胞原位注射于NSG小鼠（免疫缺陷小鼠）口腔内，作者观察到形成的口腔病变内存在一小部分慢周期性CD44^bright/dye⁺ LRCs （long-termlabel-retaining cells，长期保持标记细胞即细胞分裂水平低的细胞）（Fig1.a，b）。所以，先前发现的在口腔鳞状细胞癌（OSCC，oral squamous cell carcinomas）中具有最高的肿瘤起始潜能的CD44^bright细胞群中，在体内存在细胞周期异质性。LRCs（CD44^bright dye⁺）和非LRCs（dye^-）之间许多基因表达不同。GO分析（Geneontology analysis）表明CD44^bright dye^-特点是表达与染色体不稳定性、细胞形态改变、肿瘤、细胞周期有关基因，这些基因与肿瘤增殖性亚群一致。而LRCs存在大量与淋巴转移、肿瘤转移、对脂质的反应及脂质代谢过程有关的基因（Fig1.c，d）。

LRCs表达的基因涉及脂肪酸代谢的不同方面：脂质的摄取和转运、脂肪酸的β氧化和α氧化、脂质的生物合成及细胞内脂质贮存。在这些基因产物（gene product，即基因表达过程中形成的RNA或蛋白质）中，CD36受体能摄取细胞外的脂肪酸，使细胞能进行脂质的β氧化获得ATP能量。由于CD36是细胞表面受体，作者将其用作检测和分离LRCs的标记，以代替荧光染色。令人惊奇的是，原始口腔病变内的LRCs往往呈现CD36^bright CD44^bright。

Fig 1 | CD44^brightLRCs有淋巴结转移和脂质代谢转录组特征

a，SCC-25（一种人舌磷癌细胞系）来源的肿瘤分离出来的LRC细胞群；b，分裂细胞的比例；c，CD44^bright dye⁺细胞比例上调的前10种疾病类型；d，CD44^bright dye⁺细胞中过度激活的生物学过程和信号转导通路。

二、肿瘤转移需要CD36

        在低转移能力的肿瘤细胞系或PDCs中，过表达CD36能显著增加其转移至淋巴结的能力，转移率从低于20%增加至75%-80%。OSCC肿瘤过表达CD36引起的淋巴结转移相对于亲代细胞产生的淋巴结大小也增加了40倍。而原始肿瘤大小仅稍有些增大（少于2倍）。最重要的是，用shRNA（短发夹RNA）介导CD36耗竭可以大大减少淋巴结转移率。而且所有肿瘤细胞系中淋巴结转移的大小都显著减少，FuDa细胞（一种咽磷癌细胞系）引起的肺转移也减少，仅有一例原始口腔肿瘤的生长稍有受到影响（Fig. 2a, b）。

三、膳食脂质能够影响CD36

         CD36耗竭的细胞少有能产生淋巴结转移，进行组织学分析发现，其淋巴结转移部位中，出现充满脂滴的肿大细胞，脂滴内含有未代谢的脂质（Fig2.c，d）。而OSCC细胞产生的原始口腔肿瘤内却没有这样的表现。因此作者猜测CD36⁺细胞特异地需要脂质代谢来发挥转移的潜能。事实上，口腔原位肿瘤分离所得的CD36⁺ CD44^bright细胞表达大量的淋巴转移和脂质代谢相关的基因。其次，CD36⁺CD44^bright细胞表达更高水平的脂肪酸β氧化3种关键酶（ACADVL, ACADM and HADHA）。再次，ACSL1作用是在脂肪酸上添加一个乙酰CoA基团，耗竭ACSL1能大大减少OSCC亲代细胞和过表达CD36 OSCC细胞的淋巴结转移率，但不会减少原始肿瘤摄取脂肪酸。

Fig 2 | CD36表达的改变显著影响肿瘤转移率及转移瘤的生长

a, b，接种表达PLKO（空载体）或shRNA（靶向Cd36）肿瘤细胞的小鼠生物荧光成像（Bioluminescence imaging ，BLI）定量（a）和肿瘤原发及转移频率（b）PLKO, n = 9 mice; shCD36#98, n = 7 mice;shCD36#99, n = 6 mice；c，代表性淋巴结转移部位HE染色（LDs，lipid droplets，脂滴）；d，源于表达CD36 shRNA肿瘤细胞的淋巴结转移部位的免疫染色，插图为GFP+CD44+细胞周围的脂滴及其内游离脂肪酸。

用高脂饮食喂养NSG小鼠能够发展更多更大的淋巴结转移，这种淋巴结转移依赖于CD36 （Fig. 3a）。高脂饮食小鼠的OSCCs转移能力增强和原始口腔肿瘤及转移部位的CD36⁺细胞所占比例增加有关，表明CD36的表达对脂肪酸的浓度敏感。当OSCC细胞和OP9（小鼠骨髓基质细胞）来源的脂肪细胞共培养时，CD36⁺比例也显著增加，而与非脂肪细胞的OP9细胞或SCC相关成纤维细胞共培养时则不会增加。另外，培养的OSCC细胞暴露于软脂酸（一种能被CD36识别的脂肪酸）2天，也能显著增加CD36⁺细胞的比例。软脂酸能够以一种依赖于CD36的方式，增加淋巴结转移的大小和频率，而不影响原始肿瘤的生长。值得注意的是，软脂酸甚至能够促进10%的小鼠发生肺转移，而接种对照SCC-25肿瘤细胞的100多只小鼠里都没有观察到有肺转移（Fig. 3b）。

        重要的是，表达突变CD36（CD36-K164A）的OSCC细胞虽然内化脂质（摄取脂质）的能力受损，产生原位肿瘤病变率却和野生型CD36的细胞相同，只是大体上转移更少、更小（Fig.3c）。源自CD36-K164A肿瘤细胞的淋巴结转移也包含有大脂滴，这点与内源性CD36消耗后形成的脂滴相似。由于CD36能够激活脂肪酸β氧化，我们猜测CD36的抑制能导致内源性合成的、未经代谢脂滴的累积。这种持续性脂质的累积会最终导致代谢性脂毒性及细胞死亡。表达CD36-K164A突变及消耗了内源性CD36的肿瘤转移部位内，脂滴富集区域内及其周围能观察到Caspase-3免疫活性（细胞凋亡相关）。

Fig 3 | CD36+细胞需要摄取脂肪酸来促进转移

a，高脂饮食（high-fat diet，HFD）或对照饮食（control diet，CTD）小鼠生物荧光成像（Bioluminescence imaging ，BLI）定量和肿瘤原发及转移频率，PLKO，n = 5 mice；Cd36 shRNA，n = 5 mice；b，软脂酸（palmitic acid，PA）处理细胞来源的肿瘤的小鼠生物荧光成像定量和肿瘤原发及转移频率；LN-Met，lymph node metastasis，淋巴结转移; PT，primary tumour，原发肿瘤；PLKO, n = 10 mice；Cd36 shRNA, n = 10 mice. Unt, control vectoruntreated，未处理对照用空载体; Ct, control vectortreated with palmitic acid (PA，软脂酸处理后的空载体) and Cd36 shRNA(shCD36)；软脂酸(PA)；c，转导野生型CD36（wt，n=10）和突变型CD36（mut，CD36-K164A，n=10）后OSCC细胞来源肿瘤的小鼠生物荧光成像定量和肿瘤原发及转移频率。

四、CD36能起始肿瘤转移

在所有观察的OSCC细胞系和PDCs中，相对于原始口腔病变，CD36⁺CD44^bright细胞总是在转移部位富集。另外，敲除和过表达CD36分别能够抑制和上调与转移过程有关基因的表达。作者将OSCC细胞和来源于小鼠间质样OP9细胞的脂肪细胞共培养，用流式细胞术将其中的CD36⁺和CD36^-细胞分选出来，然后分开原位接种于NSG小鼠。在这样的共培养条件下，CD36^-中CD36 mRNA表达低于从单独培养的OSCC细胞中分离出来的CD36^-细胞。

        值得注意的是，CD36^-细胞没有产生一个淋巴结转移，而CD36⁺细胞比亲代细胞具有更高的转移率。另一方面，CD36⁺和CD36^-细胞都100%发生口腔肿瘤，且肿瘤大小相仿（Fig. 4a）。用极限稀释法进行原位接种，可确定约有1/3000的CD36⁺ CD44^bright 细胞具有转移潜能，相比整个CD44^bright细胞群增加了10倍（Fig. 4b, c）。CD36⁺ CD44^bright细胞和CD36^? CD44^bright细胞或整个CD44^bright细胞群在口腔中具有相同的致瘤能力（Fig. 4c）。而且，从口腔病变（源自接种人咽头癌胸水转移细胞系Detroit-562细胞后）或淋巴结转移（源自接种CD36⁺ Detroit-562细胞后）分选所得CD36⁺和CD36^-细胞的基因表达特征极其相似而脂质代谢的基因表达不同，所以移植后CD36⁺细胞不仅独具起始转移的能力，而且能够再现它们不同于亲代的分子及细胞异质性，之后成为真正的转移起始细胞。

Fig 4 | CD36+细胞起始和促进OSCC转移

a，CD44 ^bright CD36⁺细胞或CD44^bright CD36^?细胞或其亲代细胞系产生的肿瘤发生率及转移率；b, c，由极限稀释法测得的CD36⁺ CD44^bright或CD36^?CD44^bright或CD44^bright细胞群中转移起始细胞（metastasis-initiating cells，MIC）或肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells，TIC）频率

五、基于CD36的抗转移治疗

接下来作者用两种不同的抗CD36的中和抗体：一种能够抑制CD36的所有已知功能，包括它与血小板反应蛋白、胶原及脂肪酸的相互作用（FA6.152）；另外一种能够阻断脂肪酸和氧化低密度脂蛋白的摄取（JC63.1）。用这两种抗体处理接种了肿瘤细胞的小鼠，每3天腹腔注射抗体即能够完全抑制转移，而对原始部位肿瘤没有影响。更令人惊奇的是，每日给已经发生淋巴结转移的小鼠（接种OSCC细胞系或PDCs的小鼠）腹腔注射JC63.1抗体，淋巴结转移的大小减少80-90%，其中有15%的小鼠完全缓解，同样也没有影响原始口腔病变的大小（Fig. 5a–c）。作者观察到，在注射了CD36中和抗体的小鼠淋巴结转移处肿大细胞累积，周边存在脂质毒性和高水平caspase-3免疫活性，这一点和CD36敲除后或CD36突变（CD36-K164A）时观察到的相似（Fig. 5d）。小鼠持续注射CD36中和抗体后体重未减轻。

为了进一步评估用CD-36中和抗体来抑制转移的治疗性用途，作者在免疫健全的C3H/HeJ小鼠体内接种鼠源的Ln-7来源的OSCC细胞系再做试验。将小鼠分别用IgA（对照）或JC63.1处理，死后检验。用JC63.1治疗能抑制Ln7诱导的转移，其中一些小鼠淋巴结和肺转移完全消退。小鼠体重、肝肾重量、组织学或肝转氨酶、血红蛋白、红细胞比容、白细胞、淋巴细胞、粒细胞、中值细胞计数（单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞和其他白细胞祖细胞）、淋巴细胞、红细胞或血小板水平等均未观察到变化。

Fig 5 | CD36阻断抗体抑制OSCC肿瘤的转移

a, b，每日注射单克隆JC63.1 (5, 10 or 20 μg; n分别为7, 12 ,7 ) 或IgA对照后肿瘤BLI信号所示剂量反应；c，肿瘤消退的频率；d，转移淋巴结每日注射JC63.1后的HE染色，虚线表示脂滴环绕区域。

六、CD36的存在导致预后变差

作者接下来分析可得数据发现，CD36表达或者CD36有关标志存在和肺SCC、膀胱癌、luminal A乳腺癌患者的无病生存期短、总生存率低有关。CD36增加与许多肿瘤的转移包括高侵袭性的黑色素瘤有关。当NSG小鼠静脉内接种缺乏CD36的luminal A型乳腺癌（MCF-7）或黑色素瘤（50mel），肺转移、骨转移和肝转移的数量和大小都大大减少。

作者证明存在一小群CD36+细胞，它们具有促转移的高度倾向及脂质代谢的标志。从产生的ATP摩尔数来看，脂质β氧化是最高效的氧化形式。所以，CD36+转移细胞可能是利用这一特性来获得大量能量，以助于在远位锚定和存活。虽然阻断脂质摄取能产生脂毒性，但还不能排除抑制CD36其他功能也起到抑制转移作用的可能性。事实上，初步研究表明CD36敲除能减少OSCC细胞转移到肺，但不影响其附着于口腔或在血液循环中存活。而且，在原始病变或淋巴结转移部位中，CD36⁺细胞相比CD36^-细胞表达更低水平的EMT相关基因。这些结果表明，并不是所有肿瘤转移过程都需要EMT，亦或是转移起始细胞可能需要与其他已发生EMT的肿瘤细胞（CD36^-细胞）或肿瘤间质细胞协同，从而离开原始病变部位。

就作者的研究结果具有的治疗性意义而言，有许多证据都表明CD36⁺细胞是肿瘤转移机制之一。除了OSCC、黑色素瘤、管腔上皮型乳腺癌、膀胱癌、肺SCC，CD36也能促进胶质母细胞瘤进展，在多种肿瘤转移中都出现CD36的增加，CD36还能促进肝癌细胞的迁移。而且，脂质代谢是小鼠表皮SCC中最具侵袭性细胞的鲜明特征，也为卵巢癌转移所需。因此作者预测，靶向CD36和CD36⁺转移起始细胞能够为肿瘤转移治疗提供一个重大突破。

本次的文献解读到这儿就结束啦！我们下次再见！