|
作者：酸菜（转载请注：解螺旋·医生科研助手） 经过了几个月的闭关，全新升级版的文献精读班在今春又开班啦。本课程涵盖多个医学生物领域，通过文献精讲传授课题选择、设计方案、开展课题的套路和实用精华技巧，学以致用，帮助大家发表高质量的文章。今天分享的是上周六酸菜主讲的“开箱课程”核心内容。讲述了破骨细胞外泌体中miRNA对于成骨细胞的影响。如果大家想报名文献精读春季班的话，可以直接点击底部的“阅读原文”。 这篇Cell Discovery上的骨科文章，Cell Discovery是2014年自然出版集团（NPG）与中科院上海生命科学研究院合作的新期刊，今年影响因子估计在7、8分左右。首先来看下今天的文章题目： 其中有四个关键字：成骨细胞、破骨细胞、外泌体、miRNA，四部分连起来这篇文章也就是研究源自破骨细胞的外泌体中miRNA能够抑制成骨细胞的活性，来看看具体是怎么做的。 一、实验假说 科学研究第一步就是提出假说，然后再开始证明，这也是核心的科学思想。本文的假说如下图所示： 这里面有三个核心内容，支撑起这篇文章： 1、从破骨细胞来源外泌体能够被成骨细胞摄取并影响其成骨功能——阐释模型 2、进一步研究发现，在破骨细胞外泌体高表达miR-214，能够负调节ATF4，抑制成骨效应——提出分子 3、破骨细胞外泌体依赖于ephrinA2- EphA2信号途径影响下游效应——解释机制 研究的逻辑链就是： 二、结果解读 本文用七张大图来呈现研究的数据，可以分为四部分： 1、Fig1交代了分子的来源，并进行了对miRNA的筛选，选择了此次研究的对象miR-214； 2、Fig2-Fig4是通过了离体实验验证了外泌体以及ephrinA2- EphA2信号的生物学功能； 3、Fig5-Fig7是在动物模型中对外泌体miR-214做了功能鉴定，尤其是Fig7是对于治疗策略进一步深入的研究。 Fig1作者是要鉴定破骨细胞来源外泌体及miRNA，那首先就要做一个破骨细胞的模型。作者选了经典的小鼠RAW264.7做为前体细胞，之后加入RANKL（NF-κB受体活化因子配体）诱导2天，基本骨科做破骨细胞模型的都是这么做的。 对于外泌体的观察，作者除了用常见的电镜技术外，还用了动态光散射技术（DLS）来检测培养上清中颗粒粒径分布。两者都证明了有外泌体的存在。电镜图基本也是外泌体文章的标配。 当然，光看形态还不够，接下来还用Western做了外泌体表达的Marker蛋白鉴定，有一些Marker是非常特异的，只在外泌体中表达。这篇文章选了HSP70、TSG101、CD63（荧光标记），除此以外为了证明是外泌体，还检测了核蛋白标记，因为外泌体是没有细胞核的（可以看到Western上的空缺），这里选择了TFIIB、LaminA/C。 确定了是外泌体后，作者开始对其中的内容物进行了分析，这里用了Bioanalyzer进行片段长度的分析，在18-24 nt 处发现了丰堵富集。 接下来开始了文章的重头戏，通过高通量测序筛选比较RAW264.7和RANKL诱导的RAW264.7的外泌体miRNA，并通过查文献得知13个差异表达miRNA与骨代谢相关， qPCR验证得到9个上调的和4个下调的miRNA。 作者选择了miR-214-3p做研究对象，是一个显著表达上调的miRNA。之所以选这个miRNA，因为作者在文献中发现了这个miRNA能靶向ATF4来抑制成骨功能。这是一种略为保守的研究方案，降低了本文的学术创新，如果选一条全新的miRNA并找出靶向基因介导成骨细胞，那这篇文章的影响因子还能再高。 然后作者还非常严谨通过RNase降解实验验证了miR-214是来自于外泌体而不是凋亡小体和微泡的。这时候作者还不放心，又做了人的细胞模型，CD14+的人外周血单核细胞分选后加入macrophage colony- stimulating factor (M-CSF) 和 RANKL诱导，又做了一遍了形态学和Western检验，证实了诱导成功，当然也没放过miR-214。这就是套路，告诉了我们最完整的外泌体miRNA检测要做哪些。 Fig2开始做功能，先开始做外泌体被受体细胞摄入的观察，在细胞模型MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨细胞前体细胞）中用DiO（细胞膜绿色荧光探针）标记了外泌体，Hoechst（细胞核染料）标记MC3T3-E1细胞。在共聚焦显微镜下就能观察到破骨细胞来源外泌体被MC3T3-E1细胞摄入情况。同理用FAM标记了miR-214，观察到了外泌体中miR-214被MC3T3-E1细胞摄入情况。 然后在人成骨细胞系hFOB1.19通过PCR对miR-214的作用进行了验证。在文献中已经揭示了在miR-214的下游是ATF4，接下来就是一整套实验，先检测了hFOB1.19细胞ATF4有没有受到miR-214抑制，下游成骨细胞的相关标志物包括Alp、Bglap、Col1a1有没有受到miR-214的影响。
ALP染色活性鉴定，颜色越深成骨活性越强 整个Fig2就是说明了，破骨细胞外泌体来源的miR-214对成骨细胞的影响。 Fig3阻断了外泌体，来观察对于成骨细胞调控的影响是不是会被抑制，用了两种抑制策略：
1、中性神经鞘磷脂酶（neutral sphingomyelinase） 抑制剂 GW4869 2、外泌体释放关键基因Rab27a的siRNA 这样用两种或三种方法来说明同一个问题，能让文章的逻辑性更强。 作者又做了一套Fig2的检验来说明抑制破骨细胞外泌体对成骨细胞活性的影响。
Fig4开始机制研究，由文献知破骨细胞ephrinA2可作用于成骨细胞EphA2受体抑制成骨。Fig4a-4g沉默了ephrinA2，Fig4i-4n沉默了EphA2来观察对成骨细胞活性的影响。这些结果表明ephrinA2 / EphA2相互作用是外泌体在破骨细胞和成骨细胞之间的穿梭所必需的。 Fig5开始在体研究，用破骨细胞特异性蛋白Acp5的启动子构建miR-214 Knock in小鼠（OC-TG214）。作为一个模型的验证，首先要检测破骨细胞、成骨细胞、血清中游离miR-214和循环外泌体中miR-214的表达。
在体实验与离体实验不同，可以检测骨组织和成骨细胞中的Alp、Bglap、Col1a1表达，除此之外，还能进行形态观察发现OC-TG214鼠腰椎组织中骨小梁数量减少，骨密度降低，这也可以作为潜在的观测指标。
Fig6中作者换了人的标本，还用了OVX去卵巢小鼠模型。检测发现骨质疏松病人血清外泌体中的miR-214表达显著高于正常人，在模型中也是一样的情况。
然后作者叒对那些关键蛋白进行了检测，还是是前面那一套。骨质疏松病人和OVX模型小鼠的ephrinA2表达、Alp、Bglap、Col1a1表达。以及沉默EphA2受体后的ATF4、Alp、Bglap、Col1a1表达。 Fig7验证了一旦阻断了外泌体是否会对OVX动物模型产生治疗和缓解的作用。
Fig7a：3月龄OVX手术后8月开始注射Rab27a的脂质体siRNA，每周2次维持4周，取样检测。之后的检验方式也和前面一样，比较新的就是这里做了显微Ct吗，显示了骨体积分数、骨小梁数量、骨密度上升而结构模型指数降低，说明其对骨质疏松是有缓解作用的。
三、套路分析 这篇文章研究了破骨细胞对成骨细胞经由外泌体来交互通讯的机制，其核心就是miR-214。对miRNA的研究就可以分析出如下套路： 片段长短：Bioanalyzer 分子筛选：二代测序+qPCR 外泌体特性：Rnase+Triton 分子来源：miRNA前体检测 对于破骨细胞研究的学习也可以从几方面进行： 细胞模型： RANKL诱导RAW264.7细胞（鼠）、外周血单核细胞分选+诱导（人） 观察指标： TRAP，形态学 动物模型： 转基因、OVX 相应的成骨细胞研究也能从这些方面学： 细胞模型： MC3T3-E1 （鼠）、hFOB1.19 （人） 观察指标： Alp、Bglap、Col1a1 动物模型： 转基因、OVX 在外泌体的特性上的学习包括： 鉴定：动态光散射、电镜 标记：HSP70、TSG101、CD63 摄取：DiO荧光探针 分布：AB、MV、Exosome 阻断：GW4869、Rab27a siRNA 上述的套路就已经包含了这篇文章中的所有研究内容。那是不是只有这些值得研究呢？当然不是，比如这篇文章的主角是miRNA，完全可以改成lncRNA、circRNA以及蛋白。我们可以在其中筛选鉴定出新的分子，提出新的机制。 |
|
|
