神经学研究套路：学人家是怎么来忽悠小鼠的

原创 2017-03-16 医生科研助手 解螺旋

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 作者：叶子（转载请注：解螺旋·医生科研助手）

本次文献精读说的是神经基础科研的套路，文章发表在了Neuron上，属于神经生物领域的知名杂志。

先从题目里找关键词，第一个是Acetylated Tau，还有Synaptic Plasticity和Memory Loss。连起来就是乙酰化的Tau 抑制 KIBRA介导的突触可塑性和学习障碍。

一、实验假说

这篇文章研究了一种常见的神经疾病，阿兹海默症（AD），也就是通常说的老年痴呆。这种病会表现出很明显的学习记忆的障碍，随着时间会不断加重，是一种不可逆的大脑损伤。AD患者的大脑会发现Aβ蛋白和Tau蛋白的大量沉积。作者通过一张图来说明实验假说。

1、AD 发生后，Tau 乙酰化水平提升；

2、Tau 乙酰化水平升高后，导致Factin无法形成；导致AMPA 受体转运阻滞；

3、过度乙酰化的Tau，导致学习记忆障碍。 

二、结果解读

• Fig1说的是在AD患者的病理组织中检测到了Tau蛋白的过渡乙酰化；
  

• Fig2中作者用了一种小鼠模型，在小鼠脑部过渡表达乙酰化Tau蛋白来模拟AD的病理现象；

• Fig3-4证明过渡乙酰化的Tau蛋白会导致学习记忆的障碍（细胞层次和学习记忆障碍）；

• Fig5发现过度乙酰化的Tau，影响突触可塑性；

• Fig6-7研究了过度乙酰化的Tau是如何影响KiBRA的分子机制

Fig1作者先通过打质谱的方法找到了Tau上两个非常特殊的乙酰化位点——K274和K281

找到后，作者找了段抗原多肽从264位到287位，通过制备单克隆抗体后得到了两个单克隆抗体株——mAb359和mAb63。

mAb359：识别K274位点乙酰化；mAb63：识别K281位点乙酰化

对抗体乙酰化程度做了统计后，结果如下图：

证明的作者所得到的抗体是有用的，能够乙酰化特异位点。

在AD患者的脑组织中作者要证明Tau分子274位和281位的乙酰化是普遍存在的。作者将AD患者进行了CDR分级：0 (没有痴呆)、0.5 (中度痴呆)、5 (严重痴呆)，用WB进行检验，经过统计后，得到结果。

Tau的乙酰化水平在发生痴呆患者中要明显高于非痴呆患者平。

Fig2作者在转基因小鼠中过表达TauKQ，模拟乙酰化。观察了小鼠的海马区，发现三种转基因小鼠的胶质形成程度类似。说明后续实验得到的差异都是神经元导致的，不是胶质细胞导致的。

通过观察Tau在海马区的沉积，可以看出TauKQ和TauKQ^high 沉积明显，说明通过在小鼠海马区域过度表达乙酰化的Tau分子是可以完全模拟AD的病理特性。

Fig3通过细胞电生理层面研究学习记忆的基础——LTP功能。

tauKQ组与对照组有明显差异，说明小鼠海马部位过度表达乙酰化Tau分子，会损伤LTP功能。

乙酰化的Tau 不影响突触的基本电生理功能

Fig4是本文最经典的地方，在个体层面上，做了三个动物行为学的实验，来证明Tau乙酰化会损伤学习和记忆。

1、水迷宫实验

一种学习寻找隐藏在水中平台的实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感（空间定位）的学习记忆能力。

可以看到，在训练后24小时内，小鼠还能找到目标平台；但72小时后，过表达乙酰化Tau小鼠的记忆非常糟糕，找不到目标平台，其记忆受到了重大损伤。

2、Pattern separation memory

这是比水迷宫更加高级的学习记忆方式，在训练的时候，给小鼠的环境是这样的。

可以发现两组形状、环境都不一样，到了测试的时候，给小鼠的环境是这样的：

而啮齿类动物的天性就是对于没有接触过的新事物会有非常强的好奇心，也就是说从训练时候的环境1进入测试时候的环境1，小鼠会花大量的时间探索Y2。同理环境2的小鼠就会探索X2。

训练时候：

小鼠熟悉X1Y1、X2Y2的时间几乎是相同的。而到了测试的时候：

情况就不一样了，TauKQ^high 小鼠对于新鲜事物的探索能力大大下降了。说明乙酰化Tau抑制了小鼠的探索行为。

3、Contextual discrimination test

一个更复杂的动物行为学实验，分为3部分。先给小鼠A环境，只要小鼠在A环境，就会受到电击。让小鼠把A环境和电刺激之间等同起来。

第二步，环境会切换，从A环境到了B环境，或从B环境到了A环境，并且不进行电刺激。

小鼠这时候就会非常懵，不是A环境就要被电嘛，这次怎么不电了呢？接下来进行最后一步，继续不断的环境变化，但这个时候，A环境中的电击又来了。

这时候小鼠就崩溃了，一开始学的是A环境就会被电，然后发现不论什么环境不会被电，最后测试的时候，A环境又有电刺激，坑鼠呢！最后观察小鼠出现发抖的概率。

对于过表达TauKQ^high 小鼠来说，无论是A环境还是B环境它发抖的概率都是50%左右，没有明显差异，说明完全忘记了在A环境中被电击支配的恐惧。

三个动物行为实验都证明了乙酰化的Tau会影响学习记忆。

Fig5AB表明了乙酰化Tau 阻断GluA1的插入，Fig5C的AD病人样本中，存在Tau蛋白的高度乙酰化。

之后的研究发现，对照组中LTP促进actin 聚合；TauKQ小鼠中，乙酰化Tau 抑制了LTP引起的actin 聚合。而反过来促进 actin 聚合，可恢复受损的LTP 现象。

Fig.6显示AD病人中，KIBRA表达降低，且与乙酰化Tau 成反比。

Fig.7中过表达KIBRA，恢复LTP诱导的GluA1受体的插入和的actin 的聚合现象，从而恢复突触可塑性。

三、套路分析

本文最大的亮点就是通过3个动物行为学的实验层层递进来验证乙酰化Tau的影响，这也是因为本文所投的期刊要求较高。如果是一般5分左右的期刊，只需要做到水迷宫或T迷宫即可，后面两个复杂的实验并不是必要的。