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2017-03-31 基于全基因组来映射和刻画急性T淋巴细胞白血病中Notch调控的lncRNA. Long non-coding RNA(lncRNA)近几年已经俨然从垃圾分子摇身变成了明星分子,对这类长度大于200nt,不编码蛋白,具有很低表达,低保守性的分子的研究层出不穷,那么如何在更多研究中脱颖而出,显出高端,又不乏内涵呢?小编今天为大家提供一种新的研究思路. 今天我们要认识的文章题目叫做基于全基因组来映射和刻画急性T淋巴细胞白血病中Notch调控的lncRNA.> 这里插播一条小小的背景知识: T-ALL(急性T淋巴细胞白血病,以下简称T-ALL)是一种激进性的血液病,它的致病机制非常复杂且尚不明确,但是它有一个统一的特征---就是Notch1信号的异常. 1、识别lncRNA 当然研究lncRNA的第一步就是识别lncRNA,这篇文章的识别策略很丰富(如下图). 作者选取了T-ALL细胞系,初代T-ALL细胞以及初代T细胞进行RNA测序,经过常规的Tophat比对,Cufflinks拼接,去除已知的蛋白编码转录本后,(重点来了:)作者又剔除了长度小于200bp的转录本,去除miRNA和snRNA可能的前体转录本,移除保守性低(phyloCSF score<>的转录本,并且要求剩下的这些转录本启动子上必须有(H3K27ac,H3K4me3或H3K4me3,要求转录本启动子区域落入这三种表观信号的目的是确保我们得到的lncRNA是有转录活性的)表观信号的富集,经过这一系列条件过滤下来的才被认为是lncRNA进行后续的分析,识别到了1069个lncRNA,而且其中有一些lncRNA在T-ALL相对于正常T细胞来说是差异表达的. 2、联合ChIP-Seq的分析 得到这些T细胞相关的lncRNA之后,如何与Notch1蛋白挂钩呢?这时候ChIP-Seq(可以帮助我们看到关键蛋白与哪些基因有结合)就派上用场啦.作者下载了H3K4me3(激活信号),H3K27ac(激活信号,也是潜在的增强子信号),RNAP2(转录信号蛋白),Notch1以及其它两个与Notch1有互作的蛋白Rbpjk和Znf143. 通俗解释下,如果某个lncRNA的启动子区域有H3K4me3信号存在,说明这个lncRNA是具有活性的;如果某个lncRNA的启动子区域有RNAP2的结合信号,说明这个lncRNA是转录的;如果某个lncRNA的启动子区域有Notch1的结合信号,说明这个lncRNA与Notch1蛋白是有互作的. 下面这张图说明了我们识别到的这些lncRNA,有许多都既有激活信号,又与Notch1互作.发现了lncRNA与Notch1是有结合的,这下就有信息向下继续研究啦. 3、挖掘T-ALL中与Notch1有互作的lncRNA和mRNA. 接下来的思路作者是想找由Notch1蛋白直接调控的lncRNA,但是这个过程又有重重阻碍,需要确保是Nocth1蛋白直接调控lncRNA,作者用了一个巧妙的方法.作者选取了两个T-ALL细胞系CUTLL1和HPBALL细胞系,在两个细胞系中分别加入rSI来抑制Notch1蛋白,绘制lncRNA和mRNA在Notch1蛋白被抑制前后的FPKM散点图(如下图),横坐标为Notch1蛋白被抑制后的FPKM值,纵坐标为抑制前的FPKM值,蓝色点代表lncRNA,红色点代表mRNA.发现对角线部分有明显的分开(若lncRNA或mRNA不受Notch1蛋白的控制,那么在Notch1蛋白抑制前后它们的FPKM值应该不变,仍然在对角线上).这就说明在T-ALL中,有一些lncRNA和mRNA是受到Notch1直接蛋白影响的. 4、锁定关键基因. 前面都是一些基本现象的分析,接下来,作者锁定了一个lncRNA,叫做LUNAR1.筛选这个lncRNA的理由有如下几个. 该lncRNA与它最近邻的蛋白编码基因的相关性很高,有cis-调控的嫌疑.(如图A) 该lncRNA在T-ALL中表达很高,而在胸腺表达却很低.(如图B) 在T-ALL细胞系中,当加入Nocth1抑制剂时,该lncRNA的表达降低.(如图C).说明该lncRNA受Notch1直接调控. 在初代T-ALL中,当Nocth突变时,该lncRNA的表达明显比野生型高.(如图D) 该lncRNA定位在细胞核中.(如图E).一般认为在细胞核中的lncRNA更有可能行驶功能. 5.深入研究锁定的lncRNA 这里用到了高大上的Hi-C技术,可以识别到空间互作的分子.具体的原理大家自行搜索,在这里只捞干货吧,图A怎么看呢,有一块红色的三角形,就是表黄色阴影的上面,出现这种现象就说明,这个红块里有空间互作的现象发生.B图是A图的放大版,有没有注意到正是发现我们研究的LUNAR1和它的邻居基因IGF1R发生了空间上的互作,而且通过这些ChIP-Seq的表观数据,也告诉我们IGF1R最后一个内含子部分有很高增强子信号(H3K27ac H3K4me1),可能起到了增强子的作用,而IGF1R最后一个内含子以及和LUNAR1的启动子部分都也都有coactivators的结合信号,那么...真相只有一个...在T-ALL中,Notch与IGF1R上的增强子元件结合,控制LUNAR1表达,形成空间上的物理互作,并进一步控制IGF1R的表达. 6、实验验证+模型 基于上述一步步由粗到细,由现象到机制的分析,作者经过一系列的实验验证,证实了这种猜测,并给出了如下图的模型: 即在T-ALL中,Notch与IGF1R上的增强子元件结合,控制LUNAR1表达,连同那些coactivator共同形成空间上的物理互作,并进一步控制IGF1R的表达. 参考文献 Genome-wide mapping and characterization of Notch-regulated long noncoding RNAs in acute leukemia>(Cell, 2014, 158(3): 593-606. |
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