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·论著· 野生型PTEN过表达对体外活化大鼠肝星状细胞ERK信号转导的影响*郝礼森1 刘博1 宋小杰1 陈静3 章广玲2 莫艳波1 张朋垒1 靳丽敏1 (华北理工大学 1.附属医院消化内科，2.基础医学院，3.生命科学学院，河北 唐山 063000) 【摘要】目的 探讨野生型第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)过表达对体外活化大鼠肝星状细胞(HSC)的细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导的影响。方法 利用瞬时转染技术，以腺病毒为载体，将野生型PTEN基因转染体外培养的活化大鼠 HSC；采用Western blot及实时荧光定量PCR技术检测HSC 的PTEN、ERK1蛋白及mRNA表达；并应用Western blot技术检测HSC 的磷酸化ERK(p-ERK)表达。 结果 外源性野生型PTEN基因在活化HSC大量表达，并显著下调HSC的p-ERK 表达 (P<>P>0.50)。结论 野生型PTEN过表达通过抑制ERK的磷酸化负性调控体外活化大鼠HSC的ERK信号转导。 【关键词】肝星状细胞； 第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因； 细胞外信号调节激酶； 信号转导 肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的病理过程，肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)则是参与此过程的主要细胞，其活化、增殖及凋亡在肝纤维化的形成及发展过程中扮演重要角色[1-3]。而HSC的活化、增殖及凋亡又受多种细胞内信号转导的调控。第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN)是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因。研究证实，PTEN表达上调可通过负性调控肿瘤细胞的磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositol-3-kinase, PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B(serine-threonine protein kinase B, Akt)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)等信号转导抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[4-7]；而PTEN表达降低则可通过上调PI3K/Akt及ERK信号转导，促进肿瘤细胞增殖及抑制肿瘤细胞凋亡[8-9]。我们前期研究表明，过表达的野生型PTEN可显著抑制体外活化HSC增殖，诱导HSC凋亡，并可通过抑制 Akt 的磷酸化，负性调节活化HSC 的 PI3K/Akt 信号转导[10-12]。但PTEN对活化HSC ERK信号转导的影响仍不清楚。为此，本研究以腺病毒为载体，将野生型PTEN基因瞬时转染体外活化大鼠HSC，观察过表达的野生型PTEN对活化大鼠HSC的ERK、磷酸化ERK(Phospho-ERK, p-ERK)表达的影响，以探讨PTEN调控活化HSC增殖、凋亡的信号转导机制。 1 材料与方法1.1 试剂及细胞 表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)并携带野生型PTEN基因的重组腺病毒Ad-PTEN及仅表达GFP的空病毒Ad-GFP均由第三军医大学祝善俊教授惠赠，通过反复感染AD293细胞的方法扩增实验所需的腺病毒，并测定其滴度；表型活化的大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自中国医学科学院北京肿瘤研究所；兔抗PTEN多克隆抗体、兔抗ERK1多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；兔抗 p-ERK多克隆抗体购于美国eBioscience公司；逆转录反应体系、SYBR Green Real Master Mix购于北京天根公司；HG-DMEM培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司。 1.2 腺病毒转染体外活化HSC 在细胞培养器皿中以适当密度接种HSC，腺病毒转染前培养细胞24 h，弃去培养基并用DMEM洗涤2次，确定病毒量=细胞数×感染倍数(以感染倍数100进行转染)，用DMEM 稀释病毒液，然后在培养器皿中加入稀释好的病毒液，轻轻倾斜和摇晃培养器皿，使病毒液均匀分布，与细胞充分接触后，放入培养箱中培养2 h(每隔15 min摇晃培养器皿1次以促进感染)，补充完全培养基，37℃、5%CO2细胞培养箱内继续培养；24 h后更换完全培养基继续培养，定期应用倒置荧光显微镜观察 GFP 表达。腺病毒感染HSC 72 h，流式细胞仪检测转染效率>80%。实验分组：①Control组：腺病毒转染时以DMEM代替腺病毒。②Ad-GFP组：转染仅表达GFP的空病毒Ad-GFP。③Ad-PTEN组：转染表达GFP及野生型PTEN基因的重组腺病毒Ad-PTEN。 1.3 Western blot技术检测HSC的PTEN、ERK1及p-ERK蛋白表达 腺病毒感染HSC 72 h，消化、收集上述各组细胞，提取细胞蛋白，考马斯亮蓝比色法测定蛋白含量。应用Western blot技术检测HSC的PTEN、ERK1、p-ERK蛋白表达，一抗兔抗PTEN多克隆抗体以1:100进行稀释，其他一抗均以1∶200进行稀释，采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对Western blot结果进行定量分析，结果以目的蛋白与β-actin的积分光密度值(integral optical density, IOD)比值表示。 1.4 实时荧光定量PCR技术检测PTEN、ERK1的mRNA表达 腺病毒感染HSC 72 h，消化、收集上述各组HSC，按TRizol试剂盒说明提取总RNA，逆转录合成cDNA；PTEN、ERK1及内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)，引物参照GenBank基因序列由赛百盛基因公司协助设计及合成。引物序列：PTEN上游引物5′-TCC TGC AGA AAG ACT TGA AGG T-3′，下游引物5′-GCT GTG GTG GGT TAT GGT CT-3′，扩增产物大小为182bp；ERK1上游引物5′-CAC TGG CTT TCT GAC CGA GT-3′，下游引物5′-GCC CAC AGA CCA GAT GTC AA-3′，扩增产物大小为106 bp；GAPDH上游引物5′ -GGC TCA TGA CCA CAG TCC AT -3′，下游引物5′-ACA TTG GGG GTA GGA ACA CG -3′，扩增产物大小为202bp。在PE5700实时荧光定量PCR仪上进行实时定量扩增。SY BR 反应体系25 μl。反应条件：93℃ 5 min，1个循环；93℃ 45 s，55℃ 1 min，10个循环；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30个循环。采用相对定量2-△△Ct 法比较各组HSC的PTEN、ERK1 mRNA表达差异[13]。 1.5 统计学分析 数据以 2 结果2.1 外源性PTEN在体外活化大鼠HSC的表达 实时荧光定量PCR技术检测活化HSC的PTEN mRNA表达，以Control组PTEN mRNA表达量为1，则AD-GFP组和Ad-PTEN组PTEN mRNA相对Control组的表达倍数分别为0.99倍和1.57倍， Ad-PTEN组PTEN mRNA表达明显高于Control组及AD-GFP组(P<>P>0.05)。应用Western blot技术检测各组肝星状细胞PTEN 蛋白表达，Ad-PTEN组(1.66 ± 0.09)显著高于Control组(1.10±0.07)及AD-GFP组(1.09±0.07，P<0.05)，而control>P>0.05)。提示野生型PTEN成功转染并表达于体外活化大鼠HSC，见表1及图1。 2.2 野生型PTEN过表达对体外活化大鼠HSC ERK1表达的影响 腺病毒感染HSC 72 h，应用实时荧光定量PCR检测HSC的ERK1 mRNA表达。以Control组的ERK1 mRNA表达量为1，则Ad-GFP组和Ad-PTEN组相对Control组的ERK1 mRNA表达倍数分别为1.004倍和0.992倍，3组间ERK1 mRNA表达无明显差异(P>0.05)。进一步应用Western blot分析3组HSC的 ERK1蛋白表达，Control组HSC的ERK1蛋白表达为(1.22±0.09)，Ad-GFP组为(1.23±0.09)，Ad-PTEN组为(1.20±0.07)，3组间HSC的ERK1表达无明显差异(P>0.05)。提示过表达的野生型PTEN对体外活化大鼠HSC的ERK1 mRNA及蛋白表达均无影响，见表2及图2。 表 Table 1 Relative expression of PTEN mRNA in HSC at 72 hours after adenoviral infection  组别 △Ct△△CtRelativeexpressionfoldofPTENmRNAcomparedtocontrol对照组0.020±0.0070.0001.000Ad-GFP组0.032±0.0080.0120.993Ad-PTEN组-0.630±0.010-0.6501.569① 注：与Control组、 Ad-GFP组比较，①P<>  图1 腺病毒感染HSC 72 h Western blot 检测各组HSC的PTEN蛋白表达 Figure 1 PTEN protein expression in HSC exposed to adenovirus for 72 hours 注：A. 3组HSC的PTEN蛋白表达;B. 3组HSC的β-actin蛋白表达；C. 3组HSC的PTEN蛋白相对积分光密度值(n=6)。与Control组、 Ad-GFP组比较，①P<> 2.3 野生型PTEN过表达下调活化大鼠HSC的p-ERK表达 结果显示，Ad-PTEN组HSC的p-ERK1蛋白表达为(0.65±0.04)，显著低于Control组的(0.84±0.07)及Ad-GFP组的(0.85±0.06)，组间均有明显差异(P<0.05)；而control组与ad-gfp组之间无显著差异>P>0.05)。提示野生型PTEN过表达可显著抑制体外活化大鼠HSC 的ERK磷酸化，见图2。 表 Table.2 Relative expression of ERK1 mRNA in HSC at 72 hours after adenovirus infection  组别 △Ct△△CtRelativeexpressionfoldofERK1mRNAcomparedtocontrolControl组0.610±0.0310.0001.000Ad-GFP组0.605±0.043-0.0051.004Ad-PTEN组0.622±0.0260.0120.992  图2 腺病毒感染HSC 72 h应用Western blot 检测各组HSC的ERK及p-ERK蛋白表达 Figure 2 Western blot analysis was used for the protein expressions of ERK1 and p-ERK1 in HSC exposed to adenovirus for 72 hours 注：A. 3组HSC的ERK1 蛋白表达； B. 各组HSC的p-ERK1蛋白表达； C. 各组HSC的β-actin蛋白表达；D. 3组HSC的ERK1 及 p-ERK1蛋白相对积分光密度值(n=6), 与Control组、Ad-GFP组比较,①P<> 3 讨论PTEN是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性肿瘤抑制基因，其编码的蛋白是具有脂质磷酸酶活性及蛋白磷酸酶活性的磷酸酶，在酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶介导的信号转导中发挥重要作用。PTEN过表达可负性调控肿瘤细胞的PI3K/Akt、ERK等信号转导通路诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖[4-7]。研究证实[14]，PTEN对肿瘤细胞ERK信号通路的抑制作用主要与其蛋白磷酸酶活性有关，其表达可通过抑制上游衔接蛋白Shc的磷酸化而抑制ERK的磷酸化，进而抑制肿瘤细胞的ERK信号转导。 HSC是肝脏主要的纤维形成细胞， 其活化、增殖及凋亡在肝纤维化形成及发展过程中扮演重要角色[1-3]。众多研究显示，PI3K/Akt及ERK 信号转导通路参与了对HSC增殖及凋亡的调控。许多促肝纤维化因子，如瘦素、肝素结合的表皮生长因子样生长因子等均可通过激活HSC 的PI3K/Akt 及ERK信号通路促进HSC增殖，抑制HSC凋亡，进而促进肝纤维化[15-16]。而一些抗肝纤维化研究发现，抑制HSC的PI3K/Akt 及ERK信号转导可显著抑制HSC的增殖并诱导其凋亡，如索拉非尼及尼罗替尼均是酪氨酸激酶抑制剂，二者均能显著抑制HSC增殖，诱导HSC凋亡，其作用的发挥与ERK及Akt磷酸化被抑制密切相关[17-18]。解热镇痛药塞来昔布(一种环氧化酶2抑制剂)可通过抑制ERK及Akt的活性显著抑制HSC的增殖，诱导其凋亡[19]。此外，近年的研究发现，大麻素I型受体拮抗剂利莫那班在显示抑制HSC增殖及诱导HSC凋亡的同时，伴有ERK磷酸化的明显抑制[20]。我们的前期研究显示[10-12]，野生型PTEN过表达可诱导体外活化HSC凋亡，抑制HSC增殖，并可抑制活化HSC 的 Akt 磷酸化，进而负性调控活化HSC的PI3K/Akt 信号通路。但PTEN对活化HSC ERK信号转导通路的影响仍不完全明确。为进一步阐明PTEN是否通过ERK信号转导通路调控HSC的增殖与凋亡，本课题组将携带野生型PTEN的重组腺病毒瞬时转染活化HSC并证明PTEN大量表达后，检测了过表达的野生型PTEN对活化HSC ERK及p-ERK表达的影响。结果表明，过表达的野生型PTEN对活化HSC的ERK蛋白及mRNA表达均无影响，但明显降低了p-ERK表达。这与上述研究相一致，提示野生型PTEN过表达可通过抑制ERK的磷酸化抑制活化HSC的ERK信号转导。结合我们前期的研究结果， 提示ERK信号转导通路参与了PTEN对活化HSC增殖、凋亡的调控，是PTEN调控活化HSC增殖、凋亡的信号转导机制之一。 4 结论本研究结果显示，野生型PTEN过表达可通过抑制ERK的磷酸化负性调控体外活化大鼠HSC的ERK信号转导。 【参考文献 】 [1]Puche JE, Saiman Y, Friedman SL. 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Effects of wild type PTEN overexpression on ERK signal transduction in activated rat hepatic stellate cells in vitro HAO Lisen, LIU Bo, SONG Xiaojie, CHEN Jing, ZHANG Guangling, MO Yanbo, ZHANG Penglei, JIN Limin (The Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei, China ) 【Abstract】Objective The effects of overexpression of wild type phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten(PTEN)on extracellular signal-regulated kinase (ERK) signal transduction was investigated in activated rat hepatic stellate cell (HSC) in vitro. Methods Using transient transfection technique, adenovirus as a carrier, wild-type PTEN gene was transduced into cultivate activated rat HSC in vitro. Using Western blot and real-time fluorescent quantitation PCR, the expressions of PTEN and ERK1 were detected in HSC. And the expression of phosphorylated ERK (p-ERK) of HSC was determined using Western blot. Results The exogenous wild type PTEN gene was successfully transduced into activated rat HSC in vitro. The expression of p-ERK was significantly downregulated,P<0.05, but="" there="" were="" no="" significant="" differences="" in="" the="" expression="" of="" erk1="" at="" both="" transcriptional="" and="" translational="" levels="" in="" activated="" hsc,="">P>0.50. Conclusion Through inhibiting the phosphorylation of ERK, the ERK signaling transduction is negatively regulated by the overexpression of wild-type PTEN in activated rat HSC in vitro. 【Key words】Hepatic stellate cell; PTEN; ERK; Signal transduction 基金项目：河北省自然科学基金资助项目(H2013209327)；中国肝炎防治基金会天晴肝病研究基金资助项目(CFHPC20132078) 【中图分类号】R-33 【文献标志码】A doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2017.03.007 (收稿日期：2016-04-19； 修回日期：2016-09-10； 编辑： 母存培) |
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