丙酮酸激酶M1和M2在结直肠癌中的表达及意义*

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丙酮酸激酶M1和M2在结直肠癌中的表达及意义*

张华强1　邓明明2　王文兵1　周涛1

(1.宜宾市第一人民医院消化内科，四川 宜宾 644000；2.西南医科大学附属医院消化内科，四川 泸州 646000)

【摘要】　目的　研究丙酮酸激酶M1(Pyruvate kinase M1，M1-PK)和丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2，M2-PK)在不同临床及病理分期的结直肠癌(CRC)组织(结直肠癌组)及癌旁正常结直肠组织(对照组)中的表达与CRC临床病理特征的关系。方法　选择CRC组织标本69份,同时选择癌旁正常结直肠组织标本69份作为对照样本,采用SP法检测M1-PK和M2-PK在CRC组织中的表达。采用单因素和多因素分析比较M1-PK和M2-PK在CRC的低分化组、中分化组与正常癌旁组织中表达与临床病理特征之间的关系。采用相关分析比较CRC中M1-PK与M2-PK表达的相关性。结果　M1-PK在结直肠癌组织中表达微弱，低于癌旁正常组织，M2-PK在结直肠癌组织中表达明显高于癌旁正常组织；M1-PK在CRC组织中表达随着肿瘤分化程度降低而减少(P<0.05)><0.05)><0.05)><>

【关键词】　结直肠癌；丙酮酸激酶M1；丙酮酸激酶M2；免疫组化

结直肠癌(Colorectal Carcinoma,CRC)是一种危害性大、发病率高的恶性肿瘤，全球每年新发病例超过100 万例以上，每年超过50万患者因其死亡，在目前世界上肿瘤发病率上排列第3，在肿瘤所引起的死因中排第4位[1]。CRC的发生发展与多种因素有关,如基因多态性、个人饮食习惯、生活环境污染、遗传易感性等因素均共同或单独参与CRC的发病[2]。正常结直肠粘膜的癌变,是一个逐步进展的过程，从细胞轻度不典型增生、中度不典型增生、重度不典型增生到最终癌变，是结直肠粘膜细胞在多种致病因素影响下异常分化累积的结果[3]。丙酮酸激酶(Pyruvate kinase，PK)是糖酵解途径中的一个关键酶，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)转变为丙酮酸，PEP的高能磷酸键在催化作用下转移给二磷酸腺苷(adenosinediphosphate.ADP)生成三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)，自身生成烯醇式丙酮酸，再转变为丙酮酸。在糖酵解途径中，它是第二个以底物水平磷酸化方式生成ATP的反应，是糖酵解途径中的又一个关键限速酶[4]。哺乳动物的PK有四种同工酶，分别为L型、R型、M1型和M2型，M1-PK存在于骨骼肌、心肌和脑中；M2-PK广泛存在于肾脏、胃、肠、肝脏、脾、肺等组织中[5]。截止目前，关于M1-PK、M2-PK在结直肠癌中的表达情况，以及其与CRC的恶性程度之间的内在关系仍不完全清楚。本研究的目的旨在通过用免疫组化方式检测不同临床及病理分期的CRC细胞、癌旁正常组织细胞中M1-PK、M2-PK的表达分布情况，找出其与CRC的发展是否相关，为CRC的早期诊断、治疗提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1　实验标本来源　本实验标本全部来自宜宾市第一人民医院2013年1月～2015年1月，病理科的手术切除组织，共选择CRC组织标本69份(结直肠癌组),同时选择癌旁正常结直肠组织标本69份作为对照组,所有病理标本均具备完整甲级临床病历资料。组织来源标本具备下列条件：厚度在0.2cm以内的无受压变形组织,固定过程不超过12h。同时具备完整标准的甲级病历内容。排除患者组织标本来源合并下列情况者:长期应用糖皮质激素或免疫抑制剂患者，患有其它内分泌系统疾病;合并其它重要系统慢性器官功能衰竭患者；既往曾患结直肠恶性肿瘤患者；既往有其它器官系统肿瘤患者;应用其他具有增加恶性肿瘤风险药物的患者。

1.2　方法

1.2.1　肿瘤分期标准　病例中CRC分期参照AJCC第7版TNM分期T原发肿瘤。

1.2.2　术后标本的处理　将CRC组织标本放入10%中性福尔马林液中固定不超过12小时,取出标本,酒精浸泡，脱水两次。然后用石蜡包埋透明后的组织标本，用切片机连续切片后烤片,融蜡后固定标本,备用。

1.2.3　检测TUM1-PK与TUM2-PK在CRC组织中的表达　采用SP法，严格按照试剂盒说明书操作。石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复，30 g/L过氧化氢去离子水孵育10 min，滴加试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)，滴加一抗(两种抗体均为兔抗大鼠多克隆抗体，浓度1∶200)，滴加试剂B(生物素化山羊抗兔IgG)，二甲基联苯胺(DAB)显色。阳性反应为胞质染成棕黄色或黄色。用PBS代替一抗，其余步骤同上作阴性对照。采用Image-pro 6.0图像分析软件对图像进行分析，在400倍视野下，每张切片随机选取6个非重叠视野，测定其平均光密度值(Average optical density，AOD)，取平均值为该片的光密度值，进行统计分析。

1.3　统计学分析　采用SPSS 17.0 统计软件进行统计分析，所得数据用±s表示。采用t检验对两样本均数进行比较; 采用2检验对一般率进行比较;组间比较采用单因素方差分析; 采用双变量相关分析来统计两变量相关关系。 P<>

2　结果

2.1　TU M1-PK、TU M2-PK在正常结直肠粘膜组织和CRC组织的表达与分布　TU M1-PK、TU M2-PK在正常结直肠上皮细胞以及CRC上皮细胞中均有所表达，呈细胞质分布，阳性信号表现为黄色或棕黄色颗粒。TU M1-PK在CRC组织中表达比较微弱，中分化组中的表达较低分化组稍高，但均明显低于癌旁正常组织(对照组);TU M2-PK在CRC组织中的表达则明显升高，其中CRC低分化组表达更为显著，与对照组均有明显差异，具有统计学意义(P<>

表1　TUM1-PK TUM2-PK在CRC组织及正常结肠组织中阳性表达率比较

Tab.1　Comparison of expression positive rate of TUM1 - PK and TUM2 - PK in CRC tissue and normal colon tissue

组别nTUM1-PKTUM2-PK 2P对照组690.320±0.0260.207±0.05632.4610.007结直肠癌组690.231±0.0230.347±0.0546.9080.009 235.2317.932P<><>

表2　TU M1-PK TU M2-PK在CRC中分化、低分化组织与对照组中表达阳性率比较

Tab.2　Comparison of expression positive rate of TUM1-PK and TU M2-PK in CRC tissue(middle and low differentiated) and normal colon tissue

项目对照组(n=69)结直肠癌组(n=69)中分化组(n=48)低分化组(n=21)FPTUM1-PK0.320±0.0260.260±0.016①0.167±0.059①②35.231<><>

注：与对照组比较，①P<><>

图1　TUM1-PK在组织中的表达(免疫组化×400)

Figure1　The expression of TUM1-PK in tissue (Immunohistochemistry,×400)

注：图中呈黄色或棕黄色细胞为表达阳性细胞。a.对照组；b.低分化组TUM1-PK表达轻微；c.中等分化组TUM1-PK表达相对较多

图2　TUM2-PK在组织中的表达(免疫组化×400)

Figure1　The expression of TUM2-PK in tissue (Immunohistochemistry,×400)

注：图中呈黄色或棕黄色细胞为表达阳性细胞。a.对照组TUM2-PK表达轻微;b.低分化组TUM2-PK表达相对较多;c.中等分化组TUM2-PK表达明显增强

2.2　TU M1-PK和TU M2-PK在CRC组织中的表达与患者临床病理资料之间的关系　采用单因素和多因素分析显示，TU M1-PK在CRC组织中的阳性表达与肿瘤分化程度密切相关(P<0.05) ，肿瘤的分化程度越高，tu="" m1-pk="" 表达相对增加，肿瘤的分化程度越低，m1-pk的表达反而减少；tu="" m1-pk在crc组织中的阳性表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤tnm="" 临床分期及有无合并淋巴结转移无明显关系；tu="" m2-pk在crc组织中的阳性表达与肿瘤大小、分化程度、肿瘤tnm=""><0.05) ，相对于直径小于5cm的crc组织，tu="" m2-pk在肿瘤直径大于等于5cm的组织中表达更多；相对于t1/t2="" 期的crc组织，tu="" m2-pk在t3/t4="" 期的组织中表达更多；相对于分化程度高的crc组织，tu="" m2-pk在分化程度低的组织中表达更多；tu="">

表3　TU M1-PK、TU M2-PK在CRC组织中的表达与临床病理参数的关系

Table 3　The relationship of TU M1 - PK and TU M2 - PK in the CRC tissue expression and clinicopathological parameters

项目nTUM1-PKAOD均值PTUM2-PKAOD均值P年龄(岁) ≥65370.1380.2050.3010.238 <65320.1490.298肿瘤大小(cm) ≥5330.2310.3590.4200.036=""><5360.1900.310分化程度 中等分化480.2600.0350.2590.015="" 低分化210.1670.420tnm分期="" t1/t2期400.1910.2090.3100.011="" t3/t4期290.1880.470淋巴结转移="" 有340.1190.7120.3380.092="">

2.3　CRC组织中TU M1-PK 的表达水平与TU M2-PK 表达水平的相关性分析　CRC组织中TU M1-PK 表达水平与TU M2-PK 表达水平的相关性：采用直线相关分析显示结果如下：TU M1-PK 与TU M2-PK 表达 AOD比较r=-0.689(P<>

3　讨论

CRC在我国也相当常见，分布广泛，其发病率位居恶性肿瘤第四位，仅次于肺癌、胃癌及肝癌，其高发年龄在50岁以上,然而近年来更多深入研究表明，青年患者的患病比例及人数也在不断攀升[6]。目前诊断CRC的金标准是组织学病理活检,但取样手段有限，主要依赖于结直肠镜检查，但结肠镜检查是一种存在潜在风险的侵入性的检查,受患者年龄、心肺功能、腹水、内环境紊乱、感染、肠道准备情况等多种因素制约,而且肠道准备过程中可能出现肠梗阻，检查过程中可能发生出血、穿孔等并发症。由于结直肠属于空腔脏器，管腔大小、管壁厚度及内容物不恒定，通过腹部CT、MRI及彩超等影像学检查疗效欠佳，所发现病变多已属于中晚期病变，治疗效果及预后差。现有肿瘤标志物如CEA、CA199等敏感性及特异性偏低，不能较好适应早期准确诊断需要。因此现在迫切需要找出一些非侵入性，风险较低，且方便、快速、经济、耐受性好的检测方法来进行CRC的早期诊断，从而可以进行早期治疗，提高CRC的治疗效果、生存质量及预后，减轻CRC患者的经济负担。

无论是否有氧气存在，肿瘤细胞都不是通过氧化磷酸化进行代谢，而是主要依赖糖酵解提供能量，形成乳酸并消耗大量葡萄糖，这种异常的糖代谢现象称为Warburg效应[7]。肿瘤细胞的增殖是以几何数级倍增的过程，需要消耗大量的能量。如果细胞出现无限制的增殖,细胞终会因为营养元素供应的减少、ATP耗竭而出现死亡[8]。在细胞内调节糖酵解过程存在两种调节反应，①有氧氧化可以抑制糖酵解(Pauster效应)。②在充分给予葡萄糖时,机体都会产生很强的糖酵解作用,而有氧氧化反而减少，与有氧无氧无明显关系(Crabtree效应)[9]。在肿瘤细胞的代谢中，Pauster效应明显减弱和Crabtree效应明显增强同时存在,再加上在肿瘤细胞中M2 -PK明显过度表达，激素和饮食均无法对其调节，虽然它对底物三磷酸腺苷(ATP)抑制敏感性较低，但是对底物ADP的亲和力较大,故M2-PK可增快糖酵解速度失控性,有利于为细胞的大量增殖提供能量[10]。

在阻止细胞死亡的调节过程中丙酮酸激酶发挥着重要作用,研究表明,丙酮酸激酶通过调节ATP、丝氨酸、1,6 -二磷酸果糖(1,6 fructosediphosphate,FBP)以及不同的癌蛋白(如pp60v-src、HPV-16E7等)之间的相互作用可以调控二聚体与四聚体型M2-PK的比率,因此在这几个因素相互作用下，肿瘤细胞中出现大量二聚体型M2 -PK的形成[11]。

M1-PK基因与M2-PK基因分别编码531个氨基酸，而它们有差异的外显子则分别编码56个氨基酸，其中集中在C端的23个氨基酸存在着差异，因此导致了它们拥有完全不同的酶学特征[12]。在组织细胞中M1-PK仅能以高活性的四聚体形式存在，而M2-PK可以在低活性的二聚体与高活性的四聚体之间自由转换，其中只有四聚体形式具有丙酮酸激酶活性，能够催化与之亲和力较高的PEP转化为丙酮酸，在肿瘤细胞的代谢与增殖过程中提供了所需的能量[13]。二聚体形式的M2-PK与PEP亲和力较低，无明显丙酮酸激酶活性，不参与转化过程[14-15]。

在胚胎发育过程中，M2-PK逐渐被M1-PK所取代，而在肿瘤发生过程中L-PK或M1-PK同工酶下调而M2-PK则再度表达，M1-PK可以转化为M2-PK，因此在临床上M1-PK可作为早期诊断和治疗过程监测的重要指标[16-17]。本研究免疫组化中加入M1-PK，以观察它与CRC的关系，结果发现，M1-PK在CRC组织中的阳性表达与肿瘤分化程度密切相关(P<0.05) ，肿瘤的分化程度越高，m1-pk表达相对增加，肿瘤的分化程度越低，m1-pk的表达反而减少，提示m1-pk可能在肿瘤的发生发展过程中起到抑制作用，机理尚不清楚；m1-pk在crc组织中的阳性表达与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤tnm="" 临床分期及有无合并淋巴结转移无明显关系，提示m1-pk对于crc患者的预后评估及术后监测意义不大；本研究发现tu="" m2-pk在crc组织中的阳性表达与肿瘤大小、分化程度、肿瘤tnm=""><0.05) ，相对于直径小于5cm的crc组织，tu="" m2-pk在肿瘤直径大于等于5cm的组织中表达更多；相对于t1/t2="" 期的crc组织，tu="" m2-pk在t3/t4="" 期的组织中表达更多；相对于分化程度高的crc组织，tu="" m2-pk在分化程度低的组织中表达更多；tu="" m2-pk在crc组织中的阳性表达与患者年龄、淋巴结转移无明显关系；提示tu="">

本研究从组织学角度表明，TU M2-PK与CRC的大小及恶性程度的进展呈正相关。

Mukeher jee等通过研究TU M1-PK与TU M2-PK在不同时期多形性胶质母细胞瘤中的表达情况，检测到总蛋白中TU M1-PK与TU M2-PK均有表达，同时发现随着肿瘤恶性程度的升高，总蛋白中TU M1-PK的表达也随之升高[18-20]。而我们的研究则表明在CRC细胞中，TU M1-PK的表达随着肿瘤恶性程度升高而减低，说明在不同的恶性肿瘤中，TU M1-PK的表达有所不同。

通过比较TU M1-PK与TU M2-PK在CRC中的表达情况，我们认为TU M1-PK与TU M2-PK在CRC中的表达量的比值可以较为准确的反映出CRC的转化情况，该比值与CRC的恶性程度呈现出明显的负相关关系，即TU M1-PK与TU M2-PK的表达量的比值越大，其恶性程度越低，TU M1-PK与TU M2-PK的表达量的比值越小，其恶性程度越高。

4　结论

本研究通过免疫组化方式对CRC组织病理切片进行分析，检测TU M1-PK与TU M2-PK在不同临床及病理分期的CRC组织及癌旁正常结直肠组织中的表达以获得实验数据并证实：①TU M1-PK与TU M2-PK在正常结肠上皮细胞及CRC上皮细胞中均有所表达，在CRC细胞中TU M2-PK的总蛋白表达情况初步反应肿瘤大小、肿瘤分期及肿瘤分化程度。②从组织表达角度提示，TU M1-PK与CRC的恶性程度及进展呈反比例关系，而TU M2-PK与CRC的恶性程度以及进展呈正比例关系。③PK的活性与CRC的恶性程度呈正比例关系，比较TU M1-PK与TU M2-PK表达情况，我们认为TU M1-PK与TU M2-PK的表达量的比值可以更加准确反映出CRC恶性程度及进展情况，这个比值与CRC的恶性程度及进展情况之间呈现出明显的反比例关系，也就是说如果TU M1-PK与TU M2-PK的比值越大，组织恶性程度反而越低，而TU M1-PK与TU M2-PK的比值越小，组织恶性程度则越高，这为CRC的检测及治疗提供了新的思路和判断依据。

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基金项目：四川省卫生厅科研课题(201005682)

【中图分类号】　R 735.3+5　　

【文献标志码】　A　　　

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.005

(收稿日期：2015-12-17；编辑：陈舟贵)

Expression and clinical significance of pyruvate kinase M1 and M2 on colorectal cancer

ZHANG Huaqiang1,DENG Mingming2,WANG Wenbing1,et al

(1.Department of Gastroenterology,The People’s Hospital of Yibin,Yibin 644000,Sichuan,China;2.Department of Gastroenterology,The Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan,China)

【Abstract】　Objective　To explore pyruvate kinase M1 (M1-PK) and Pyruvate kinase M2 (M2-PK) in CRC expression with the relationship between disease development.Methods　69 specimens of CRC tissue were studied and 69 normal colorectal tissue beside CRC tissue were control in the present study.The expression of M1-PK and M2-PK were measured with SP method.The relation of expression of M1-PK and M2-PK of Low differentiation group,middle differentiation group and normal tumor adjacent tissue and clinicopathological characteristics was analyzed.The correlation of expression of M1-PK and M2-PK was explored.Results　The expression of M1-PK in CRC tissues decreased as the degree of tumor differentiation.The expression of M2-PK in CRC tissues increased with tumor differentiation degree reduced (P<0.05).the expression="" and="" clinical="" pathological="" features="" shown="" that="" the="" positive="" expression="" of="" m1-pk="" in="" crc="" tissues="" was="" closely="" related="" to="" the="" degree="" of="" differentiation=""><0.05),but with="" the="" patient="" age,tumor="" size,tumor="" location,clinical="" tnm="" stages="" and="" lymph="" node="" metastasis.m2-pk="" in="" the="" tissue="" of="" crc="" positive="" expression="" and="" the="" tumor="" size,tumor="" was="" closely="" related="" to="" the="" clinical="" tnm="" staging="" and="" differentiation="" degree="" of="" tumor=""><0.05),but with="" the="" patient="" age,tumor="" location,presence="" of="" lymph="" node="" metastasis,no="" obvious="" relationship.the="" results="" shown="" that="" the="" m1-pk="" compared="" with="" m2-pk="" express="" aod.conclusion="" the="" ratio="" of="" m1-pk/m2-pk="" might="" be="" used="" as="" the="" malignant="" degree="" and="" the="" progress="" of="">

【Key words】　Colorectal cancer; Pyruvate kinase M1; Pyruvate kinase M2; Immunohistochemical