Lp-PLA2活性水平及基因多态性与缺血性脑卒中的相关性李苏亮，叶 芸 （西安医学院第一附属医院，陕西 西安 710077） 摘要：目的 研究脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）活性水平及其基因位点rs1051931（Ala379Val）多态性与缺血性脑卒中（ICS）的相关性。方法 采用聚合酶链反应（PCR）及基因测序技术检测480例ICS患者和630名健康体检者（正常对照组）Lp-PLA2基因rs1051931位点多态性，同时测定血浆Lp-PLA2活性及血脂［包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）］、血糖（Glu）水平。结果 ICS组男性比例、患高血压比例、Lp-PLA2活性及TG、TC、HDL-C、LDL-C、Glu水平均明显高于正常对照组（P＜0.05），而2个组之间年龄、体重指数（BMI）差异均无统计学意义（P＞0.05）。ICS组具有更高水平的传统危险因素（高血压、相对较高的LDL-C水平及相对较低的HDL-C水平）。校正传统危险因素（高血压、高血糖、高血脂）后，Lp-PLA2活性的最高四分位数与最低四分位数相比，比值比（OR）［95%可信区间（CI）］为2.25（1.23～9.96）。CC、CT、TT基因型的Lp-PLA2活性［中位数（四分位数）］分别为56.44（27.56～87.84）、43.26（26.73～78.51）、38.24（22.98～62.84）nmol/（mL·min），3种基因型之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。以Lp-PLA2基因型为自变量进行Binary Logistic回归分析，结果显示ICS组CC基因型频率较高，OR值（95%CI）为1.707（1.055～2.761）。结论 ICS患者血浆Lp-PLA2活性高于健康人群。Lp-PLA2基因多态性与ICS的发病有关，CC基因型是ICS发病的危险因素。 关键词：脂蛋白相关磷脂酶A2；单核苷酸多态性；缺血性脑卒中 缺血性脑卒中（ischemic cerebral stroke，ICS）的基本病因是动脉粥样硬化。近年来的研究表明动脉粥样硬化本质上是一种慢性炎症反应过程［1］。脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoproteinassociated phospholipase A2，Lp-PLA2）作为一种炎性标志物与动脉粥样硬化发生和ICS的发病密切相关［2］。Lp-PLA2是磷脂酶A2超家族的一个亚型，主要由巨噬细胞和淋巴细胞产生，具有促进冠状动脉粥样硬化的作用［3］。已有研究证实Lp-PLA2在缺血性脑血管病发病过程中起着重要的促进作用［4］。Lp-PLA2基因多态性可能与ICS的发病有一定的关联［5-6］。然而，有研究报道显示Lp-PLA2基因多态性与血浆Lp-PLA2水平无明显相关性［7］，在脑卒中发生后血浆Lp-PLA2水平未发生很大的变化［8］。有关Lp-PLA2基因多态性与脑卒中相关性的研究结论并不完全一致。因此，我们探讨了Lp-PLA2基因rs1051931（Ala379Val）位点多态性与血浆Lp-PLA2活性水平及ICS发病的相关性。 材料和方法一、研究对象 选取2008至2013年西安医学院第一附属医院神经内科住院的ICS患者480例，其中男280例，女200例，年龄32～76岁。纳入标准：符合中华医学会神经病学分会制定的缺血性脑卒中诊断标准［9］。排除标准：严重心、肝、肾及血液系统疾病，自身免疫性疾病。同时随机抽取同期西安医学院第一附属医院体检中心正常体检者630名作为正常对照组，其中男256名，女374名，年龄28～73岁。正常对照组年龄、体重均与ICS组匹配。本研究得到了西安医学院第一附属医院伦理委员会的批准，并获得了所有研究对象或患者亲属的同意。 二、方法 1.ICS患者信息采集 本研究设计了1份问卷调查表，用于采集流行病学信息，包括被调查者的姓名、性别、年龄、身高、体重、高血压患病情况等。 2.样本采集及血脂、血糖（glucose，Glu）、血浆Lp-PLA2活性检测 采集研究对象清晨空腹静脉血3 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝，30 min 内于2～8 ℃、1 200×g离心20 min，分离上清液，-80 ℃保存。血脂项目［总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）］及Glu水平采用OLYMPUS AU640全自动生化分析仪（日本OLYMPUS光学株式会社）及配套试剂（批号分别为AUZ2850、AUZ2923、AUZ3207、AUZ2996、AUZ2858）检测。血浆Lp-PLA2活性测定采用酶水解底物显色法（美国Cayman公司PAF-AH活性测定试剂盒，批号005261），仪器为Thermo Scientific Multiskan FC全自动酶标仪（美国赛默飞世尔公司）。 3.人全血样本基因组DNA提取 全血基因组DNA提取试剂盒（批号B132700）由北京百奥森泰生物技术有限公司提供，严格按试剂盒要求进行操作，提取的基因组DNA于-80 ℃保存备用。 4.Lp-PLA2基因rs1051931位点多态性分析 参照文献［10］设计引物，由上海生物技术工程有限公司合成，目的基因序列号为NC000006.11（Exon11）：上游 5'-TTTTA AATGTCTTGTTCTCT-3'；下游 5'-GGTCA TGAAAAAAATAGTTT-3'。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）总反应体系为50 μL：模板DNA 10 μL，Premix Ex TaqDNA聚合酶25 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，加无菌蒸馏水至50 μL。循环参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s、61 ℃退火10 s、72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增反应结束后在2%琼脂糖凝胶中进行电泳分析，电泳缓冲液为1×TAE（Tris-ACETATEEDTA），在110～120 V电压下电泳60 min。PCR扩增产物由上海生物技术工程有限公司进行DNA测序分析。 三、统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。年龄和体重指数（body mass index，BMI）呈正态分布，采用 结 果一、ICS组及正常对照组一般资料比较 ICS组男性比例、患高血压比例、Lp-PLA2活性及TG、TC、HDL-C、LDL-C、Glu水平均明显高于正常对照组（P＜0.05），而2个组之间年龄、BMI差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。 表1 ICS组及正常对照组一般资料比较  组别 例数 年龄 男性［例（%）］BMI（kg/m2） 高血压［例（%）］ TC（mmol/L）ICS组 480 57±13 280（58.3） 24.5±3.7 335（69.7） 6.15（4.56～7.21）正常对照组 630 56±13 256（40.6） 24.1±3.6 212（33.6） 5.67（3.96～6.61）统计值 0.348 10.177 1.691 90.045 -2.561 P值 0.729 0.001 0.096 0.001 0.01组别 TG（mmol/L） HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L） Glu（mmol/L） Lp-PLA2［nmol/（mL·min）］ICS组 1.88（1.02～3.18） 1.0（0.71～1.32） 2.86（1.77～3.42）6.52（5.02～8.78） 45.67（22.98～87.84）正常对照组 1.51（0.89～2.75） 1.2（0.90～1.58） 2.13（1.56～3.27）5.48（3.89～6.71） 19.77（5.68～40.64）统计值 -2.784 -5.366 -2.616 -2.698 -8.102 P值 0.005 0.001 0.009 0.001 0.001 二、Lp-PLA2基因rs1051931位点多态性分析 PCR扩增目的基因片断长度为199 bp，见图1。基因测序结果显示Lp-PLA2基因有CC、CT和TT 3种基因型，见图2。 三、Lp-PLA2活性与ICS的关系  图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 注：M为Marker，1～6为PCR扩增产物，199 bp处为目的条带  图2 Lp-PLA2基因rs1051931位点单向测序 注：（a）CC基因型；（b）CT基因型；（c）TT基因型；箭头所指为多态性位点 按Lp-PLA2活性的四分位数区间将ICS患者分为4组，由低到高依次为Q1组、Q2组、Q3组、Q4组。采用Logistic逐步回归分析评估不同Lp-PLA2活性的个体患病风险。校正年龄和性别后，最高四分位数的Q4组与最低四分位数的Q1组相比，其比值比（odds ratio，OR）［95%可信区间（confidence interval，CI）］为6.52（2.34～22.05），见表2中的模型1。在模型1的基础上进一步校正高血压、Glu，其OR值（95%CI）为3.12（1.67～12.26），见表2中的模型2。在模型2的基础上进一步校正TG、TC、LDL-C和HDL-C，其OR值（95%CI）为2.25（1.23～9.96），见表2中的模型3。 表2 Lp-PLA2活性与ICS的关系 ［OR值（95%CI）］  注：模型1为校正年龄和性别；模型2为在模型1的基础上进一步校正高血压、Glu；模型3为在模型2的基础上进一步校正TG、TC、LDL-C和HDL-C 组别 Lp-PLA2［nmol/（mL·min）］ 例数 模型1 模型2 模型3 Q1组 22.98～＜45.35 102 1.00 1.00 1.00 Q2组 45.35～＜53.62 135 1.44（0.61～2.32） 1.36（0.79～1.67） 1.24（0.62～1.58）Q3组 53.62～＜66.73 140 1.56（0.89～2.37） 1.47（0.68～1.95） 1.27（0.51～1.14）Q4组 66.73～＜87.84 103 6.52（2.34～22.05） 3.12（1.67～12.26） 2.25（1.23～9.96） 四、Lp-PLA2基因rs1051931位点多态性与ICS的关系 ICS组及正常对照组Lp-PLA2基因多态性均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。Lp-PLA2基因rs1051931位点多态性有3种基因型（CC型、CT型和TT型）。以ICS（是，否）为因变量，Lp-PLA2基因型为自变量，进行Binary Logistic回归分析。结果显示ICS组CC基因型频率较高（0.504）、TT基因型频率较低（0.229），OR值（95%CI）为1.707（1.055～2.761），P=0.02。ICS组T等位基因频率较低（0.20），C等位基因频率较高（0.80），OR值（95%CI）为2.913（1.203～7.047），P=0.018。 表3 Lp-PLA2基因Ala379Val多态性基因型及等位基因频率比较 ［例（频率）］  组别 例数 基因型频率 等位基因频率CC CT TT C T ICS组 480 242（0.504） 12（0.267） 11（0.229） 38（0.80） 96（0.20）正常对照组 630 192（0.362） 15（0.289） 18（0.349） 33（0.64） 191（0.36）OR值（95%CI） 1.707（1.055～2.761） 2.913（1.203～7.047）P值 0.02 0.018 五、不同基因型患者Lp-PLA2活性的比较 CC、CT和TT基因型患者的Lp-PLA2活性分别为 56.44（27.56～87.84）、43.26（26.73～78.51）、38.24（22.98～62.84）nmol/（mL·min），3种基因型之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。  图3 不同基因型患者Lp-PLA2活性的比较 讨 论ICS的基本病因是动脉粥样硬化。近年来的研究表明动脉粥样硬化本质上是一种慢性炎症反应过程［1，11-12］。Lp-PLA2是磷脂酶A2超家族的一个亚型，主要由巨噬细胞和淋巴细胞产生，其作为一种炎性标志物与动脉粥样硬化的发生和ICS的发病密切相关［2，13］。本研究显示，ICS组血浆Lp-PLA2活性明显高于正常对照组（P＜0.05），证实ICS的发病与Lp-PLA2活性有关［14-15］。而对于Lp-PLA2基因rs1051931位点多态性与ICS患者血浆Lp-PLA2活性的相关性研究则有待于进一步深入。 本研究采用Logistic逐步回归分析校正ICS的传统危险因素后，ICS患者Lp-PLA2活性的最高四分位数（Q4组）与最低四分位数（Q1组）相比，OR值（95%CI）为2.25（1.23～9.96）。以上结果表明ICS患者具有较高的Lp-PLA2活性，进一步证实Lp-PLA2是ICS发病风险的预测因子。 多态性分析发现Lp-PLA2基因rs1051931位点多态性有3种基因型（CC型、CT型和TT型）。Binary Logistic回归分析显示，ICS组CC基因频率较高（0.504），TT基因频率较低（0.229），OR值（95%CI）为1.707（1.055～2.761），P=0.02。ICS组T等位基因频率较低（0.20），C等位基因频率较高（0.80），OR值（95%CI）为2.913（1.203～7.047），P=0.018。该结果说明Lp-PLA2基因rs1051931位点多态性与ICS的发病有关。CC基因型患者的Lp-PLA2活性最高，TT基因型患者最低。因此，CC基因型可能与ICS的发病相关，携带C等位基因者可能成为患ICS的高危人群。 综上所述，本研究探讨了Lp-PLA2基因多态性与ICS患者血浆Lp-PLA2活性的相关性。综合分析显示Lp-PLA2活性在ICS患者中明显升高，是ICS的危险因素；CC基因型的基因频率明显升高且Lp-PLA2活性最高。本研究结果有助于从分子机制探讨ICS的危险因素，从而筛选出高危人群。但ICS的发病机制复杂，还需更多的研究来进一步明确Lp-PLA2基因多态性在ICS中的作用。 参考文献 ［1］STEWART RA，WHITE HD. The role of lipoproteinassociated phospholipase a2as a marker and potential therapeutic target in atherosclerosis［J］. Curr Atheroscler Rep，2011，13（2）：132-137. ［2］POLUPANOV AG，LOMTEVA IUN，KHALMATOV AN，et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2：relation to development of ischemic stroke in patients with essential hypertension［J］. Kardiologiia，2014，54（6）：29-34. ［3］RYU SK，MALLAT Z，BENESSIANO J，et al. Phospholipase A2 enzymes，high-dose atorvastatin，and prediction of ischemic events after acute coronary syndromes［J］. Circulation，2012，125（6）：757-766 . ［4］LIU X，ZHU RX，TIAN YL，et al. Association of PLA2G7 gene polymorphisms with ischemic stroke in northern Chinese Han population［J］. Clin Biochem，2014 ，47（6）： 404-408. ［5］KARA H，AKINCI M，DEGIRMENCI S，et al. High-sensitivity C-reactive protein，lipoproteinrelated phospholipase A2，and acute ischemic stroke［J］. Neuropsychiatr Dis Treat，2014，10：1451-1457. ［6］TAI W，GARCIA M，MLYNASH M，et al. Lipoprotein phospholipase A2 mass and activity are not associated with the diagnosis of acute brain ischemia［J］. Cerebrovasc Dis，2014，38（5）：324-327. ［7］WOOTTON PT，STEPHENS JW，HUREL SJ，et al. Lp-PLA2 activity and PLA2G7 A379V genotype in patients with diabetes mellitus［J］. Atherosclerosis， 2006，189（1）：149-156. ［8］ELKIND MS，LEON V，MOON YP，et al. High-sensitivity C-reactive protein and lipoproteinassociated phospholipase A2 stability before and after stroke and myocardial infarction［J］. Stroke， 2009，40（10）：3233-3237. ［9］ 中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会脑血管病学组. 中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014［J］. 中华神经科杂志，2015，48（4）：246-257. ［10］KRUSE S，MAO XQ，HEINZMANN A，et al. The Ile198Thr and Ala379Val variants of plasmatic PAF-acetylhydrolase impair catalytical activities and are associated with atopy and asthma［J］. Am J Hum Genet，2000，66（5）：1522-1530. ［11］HARTMAM J，FRISHMAN WH. Inflammation and atherosclerosis：a review of the role of interleukin-6 in the development of atherosclerosis and the potential for targeted drug therapy［J］. Cardiol Rev，2014，22（3）：147-151. ［12］WARNATSCH A，IOANNOU M，WANG Q，et al. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis［J］. Science，2015，349（6245）：316-320. ［13］CAO J，HSU YH，LI S，et al. Structural basis of specific interactions of Lp-PLA2 with HDL revealed by hydrogen deuterium exchange mass spectrometry［J］. J Lipid Res，2013，54（1）：127-133. ［14］叶芸，李苏亮. 脑卒中患者血浆Lp-PLA2水平及临床意义探讨［J］. 检验医学，2014，29（3）：249-253. ［15］龙璐，王钟明，陈贞，等. 急性缺血性脑卒中患者血浆Lp-PLA2水平与颈动脉硬化斑块稳定性及神经功能缺损程度的关系［J］. 检验医学，2013，28（10）：885-889. （本文编辑：龚晓霖） Correlations of Lp-PLA2 activity and gene polymorphism with ischemic cerebral stroke
Abstract：Objective To investigate the correlations of lipoprotein-associated phospholipase A2（Lp-PLA2）activity and its gene locus rs1051931（Ala379Val） polymorphism with ischemic cerebral stroke（ICS）. Methods Polymerase chain reaction（PCR） and direct sequencing assay were used to determine rs1051931 polymorphism in 480 patients with ICS and 630 healthy subjects（healthy control group）. Plasma Lp-PLA2 activity，total cholesterol（TC），triglyceride（TG），high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C），lowdensity lipoprotein cholesterol（LDL-C） and glucose（Glu） were determined simultaneously. Results The proportion of males，the proportion of hypertension，Lp-PLA2 activity，TG，TC，HDL-C，LDL-C and Glu in ICS group were higher than those in healthy control group（P＜0.05）. The differences of ages and body mass index（BMI） between the 2 groups were not statistically significant（P＞0.05）. ICS group had high levels of traditional vascular risk factors，including relatively-high blood pressure and LDL-C and relatively-low HDL-C. After the calibration of traditional vascular risk factors，the highest and lowest quartiles of Lp-PLA2 activity were analyzed｛odds ratio（OR）［95% confidence interval（CI）］ =2.25（1.23-9.96）｝. Lp-PLA2 activities ［median（quartile）］were 56.44（27.56-87.84）nmol/（mL·min） in genotype CC，43.26（26.73-78.51）nmol/（mL·min） in genotype CT and 38.24（22.98-62.84）nmol/（mL·min） in genotype TT（P＜0.05）. By Binary Logistic regressionanalysis，Lp-PLA2 genotype was used as an independent variable，the frequency of genotype CC in ICS group was high ［OR（95%CI）=1.707（1.055-2.761）］. Conclusions Lp-PLA2 activity in ICS group is higher than that in healthy control group，and its polymorphism is correlated with ICS. Genotype CC is a risk factor for ICS. Key words：Lipoprotein-associated phospholipase A2；Single nucleotide polymorphism；Ischemic cerebral stroke 文章编号：1673-8640（2016）010-0869-05 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.010.007 基金项目：陕西省教育厅科研计划项目（11JK0723 ）；西安医学院第一附属医院科研项目（XYFY14-02） 作者简介：李苏亮，男，1973年生，学士，副主任技师，主要从事临床免疫学检验工作。 通讯作者：叶 芸，联系电话：029-84277552。 收稿日期：（2016-01-26） |
|
|
±s表示，组间比较采用t检验。TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu、Lp-PLA2呈偏态分布，采用中位数（M）［四分位数（P
