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生物极客 来自生物极客 00:00 08:16 音频部分为大程讲解 提取RNA的实验中各个试剂的作用是什么？ 用Trizol进行抽提，基本就是酸性酚抽提法。 RNA提取主要是内源和外源RNase trizol中有酚和异硫氰酸胍，和B-巯基乙醇 trizol中有酚和异硫氰酸胍，和B-巯基乙醇 酚能使核蛋白质与核酸解聚（氯仿也可以），酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，可以加入0.1%的8－羟基喹啉，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。 B-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。 加入氯仿，虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。一般的trizol试剂在4度下是油状悬浮液，提高温度，放置一段时间，自然也会分相。 上层水相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量） 氯仿还可以去除植物色素和蔗糖。在氯仿中加入少许异戊醇目的很简单，为了减少蛋白质变性操作过程中的气泡。 氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。 异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必是你的RNA降解。但是难以挥发出去。 最后的乙醇主要是洗涤异丙醇，也可以溶解一部分蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉。 附件第四版分子克隆详细protocol：
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