|
2019年5月16日 ZJUResearch第18期前言 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA，分离RNA之后通过逆转录及荧光定量PCR可对基因的表达水平进行检测，从分子水平进一步完善研究内容。Trizol法提RNA因其具有操作简单，回收率高和提取的RNA质量高的优势成为现在普遍运用的一种RNA提取方法。1 原理 Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。再使用异丙醇沉淀水相中的RNA，乙醇洗涤沉淀中残留的有机溶剂，最终风干得到较纯的RNA。  2.实验步骤 2.1 RNA提取： 1. 实验区喷RNA酶抑制剂 2. 将培养软骨细胞24孔板中的培养基吸尽弃掉，加500ulPBS洗涤弃掉之后，每孔加入500ultrizol,室温放置5min,吹打混匀之后转移到1.5mlEP管中（因trizol有毒且味道重，此步需要在通风橱中操作），若近期不进行提取可冻存于-80℃冰箱待用。 3. 1中每个EP管中对应加入100ul的氯仿（三氯甲烷）（Trizol:氯仿=5:1），上下晃15s, 振荡混匀，室温静置10min 4. 预冷离心机，12000rcf, 4℃离心15min，离心之后分为三层，上层为RNA,中间分界层为DNA与蛋白质，下层为有机相 5. 在离心间隙准备新的EP管，待离心结束后将上层RNA小心转移至1.5mlEP管中（每管吸约200ul,宁少勿多） 6. 加入等量的异丙醇上下颠倒充分混匀，室温静置10min 7. 离心：12000rcf,4℃，10min 8. 弃上清，加入75%乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁 9. 离心：12000rcf,4℃，5min 10. 弃上清（可先倾倒，再瞬时离心（3min）后用枪头吸），风干10min 11. 根据沉淀大小，加入10ul(沉淀不可见)或20ul（沉淀可见）DEPC水4℃溶解RNA，在冰上静置溶解30min 12. 测浓度：利用Nanodrop，操作流程为：Nucliec Acid → DEPC水起始→ 选择“RNA40”→ Blank →1μl测浓度2.2 逆转录 1. 65℃金属浴5min，转移到冰上放置大于5min 2. 加样：(冰上操作)  3.逆转PCR流程 37℃ 15min-->50℃ 5min--> 98℃ 5min--> 4℃ hold 结束后冻存在-20℃冰箱待用 注意事项 1. 所有使用的EP管及枪头都应是RNA专用，即均需在生物安全柜中打开（无RNA酶污染） 2. 75%的乙醇是由DEPC水和无水乙醇配制，现配现用，并且配制完成需要在冰上预冷 3. 关于RNA浓度测定，记录RNA浓度的同时需要关注260/280的值，一般，260/280在1.8~2，小于1.7表明有蛋白质污染，大于2可能存在核酸降解 4. 关于加样中RNA加多少μl的计算，需要的RNA量为1μg, 比如测出来的RNA浓度为200ng/ul,则需加5ul达到1μg，10ul体系对应的加Nuclease-free water（如DEPC水）为3ul有你想看的精彩 “肿瘤干细胞—成球实验””新生大鼠海马神经元原代培养“ "免疫组化IHC技术"END 编辑：王江勤 李幼农 作者：盛紫璇 |
|
|
