益生菌发酵山药红牛骨肽营养粉活菌制剂关键工艺研究

摘要：为了探究用益生菌发酵山药红牛骨肽营养粉活菌钙制剂的关键工艺, 试验采用三联益生菌小剂量培养法发酵山药红牛骨肽营养粉。结果表明: 适宜的关键工艺参数: 山药粉30%, 红牛骨粉35%, 果葡糖浆20%, 酪蛋白磷酸肽4%; 经121 ℃、20 min灭菌后, 紫外线灯下37 ℃、24 h振摇培养。发酵品钙含量为29 537.23 mg/100 g、磷含量为15 041.6 mg/100 g, 钙、磷比例接近人体所能吸收的最佳比例2︰1的水平。产品的理化指标、微生物指标均达到国家食品要求标准, 是极具开发前景的一种补钙活菌制剂。

关键词：益生菌; 发酵; 山药; 红牛骨粉; 活菌钙制剂; 关键工艺

三联益生菌（金双歧）中的长双歧杆菌具有调节人体肠道、改善健康的功效[1]；保加利亚乳杆菌能促进胃排空，提高钙、磷利用率，抑制有害细菌[2]；嗜热链球菌可以帮助乳糖的消化，产生胞外多糖、细菌素和维生素[3]。利用这三联菌联合发酵不仅可以极大提高产品的游离钙离子的数量，促进人体钙磷的吸收，还可以增加人体肠道有益菌群数量，预防便秘，促进消化，减少骨类疾病发生[4-5]。

以平凉特产山药、红牛鲜骨为原料，通过添加酪蛋白磷酸肽、果葡糖浆，经过均质乳化、三联益生菌发酵和低温干燥等新工艺开发研制山药红牛骨肽益生菌营养粉活菌制剂，旨在改善平凉山药“外销不畅，内销不旺”的困顿局面[6]，降低平凉红牛骨资源废弃、附加值低、造成资源浪费和环境污染的现状[7]，为补钙活菌制剂的研发探索一条新路子。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲜山药：市售；鲜红牛骨：平凉市天源牧业有限公司；酪蛋白磷酸肽：食品级；果葡糖浆：食品级；三联益生菌片（内蒙古双奇药业股份有限公司），0 ℃～4 ℃冷藏条件下。柠檬酸、抗坏血酸、壳聚糖、石油醚、考马斯亮蓝、酪蛋白、磷酸、EDTA、CaCO3、盐酸、氢氧化钾、酚酞等化学试剂均为分析纯。

1.2 试验设备与仪器

FW-100型万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；DHG-9123A电热恒温热风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；130G型胶体磨：山东龙兴化工机械集团；TM-329高压灭菌釜：东明公司；SLS-60-7高压均质机：上海申鹿均质机有限公司；MS-250锯骨机：苏州爱马知星机电设备有限公司；UV-755N紫外-可见光分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；凯氏定氮仪：北京海光仪器公司；JB-CJ-1FC超净工作台：济南腾昊科学仪器有限公司；SNJA10K5智能密封八分杯酸奶机：广东小熊电器有限公司炉；等。

1.3 速溶平凉山药粉制备

新鲜山药清洗去皮，5 mm厚切片，漂烫（70℃，5 min），护色处理（1.5%柠檬酸+3.0% VC+0.6%壳聚糖，1 h），40 ℃风干，粉碎过筛（100目）备用。

1.4 超细红牛骨粉制备

市售的鲜红牛骨切割成大小基本一致的骨块，冷水浸泡3～5 h去除血水与杂质，流水清洗3次，低温冷冻（-20 ℃，24 h）后粉碎，粒度10 cm左右。初碎的骨粒经压力02～0.4 kPa，121 ℃，90 min高温蒸煮，加水离心、过滤除脂后，骨浆经磨浆机粗磨，再用胶体磨超细化粉碎，低温干燥备用。

1.5 山药红牛骨肽营养粉的正交优化试验

利用L16(44)正交试验（见表1）。A代表红牛骨粉，B代表果葡糖酱，C代表山药粉，D代表酪蛋白磷酸肽，每个试验组测3次，然后取平均值，以所得营养粉钙含量为标准比较确定最佳配方。

表1 试验因子与水平表

D酪蛋白磷酸肽/g·(100 g)-112010251 22515302 33020353 43525404水平因素A红牛骨粉/ g·(100 g)-1B果葡糖酱/ g·(100 g)-1C山药粉/ g·(100 g)-1

用极差分析法对试验结果做直观分析。

1.6 三联益生菌山药红牛骨肽营养粉发酵试验

1.6.1 山药红牛骨肽发酵液与种子液的制备

肽营养粉添加双蒸水配制成发酵液，121 ℃灭菌20 min。益生菌发酵种子液配方：平凉山药粉20%、红牛骨粉15%、脱脂乳10%、双蒸水55%。将上述各成分混合，用1 mol/L NaOH（HCl）调节pH到6.5，121 ℃，20 min灭菌。每百毫升种子液取一片双歧杆菌乳杆菌三联活菌片接种，振荡均匀，以10 mL无菌分装于无菌试管，加塞密封，37 ℃振荡培养24 h。初接种时，每百毫升种子液中活菌数大于0.6×107CFU/mL。

1.6.2 发酵液中种子液的添加及发酵方法

每百毫升发酵液加入10 mL种子液，见表2。装于SNJ-A10K5智能密封八分杯酸奶机（用双蒸水润洗，置于超净工作台紫外灯下30 min灭菌），每杯110 mL，盖杯盖且用密封，紫外灯下37 ℃振荡培养24 h后，将发酵制品室温晾干，压片成品，以钙转化率与总酸度为评价指标。

表2 发酵因子与水平表

水平因素A发酵液/%B益生菌/片C双蒸水/% 1 401.060 2 501.550 3 602.040 4 702.530

1.7 评价指标

（1）蛋白质测定：考马斯亮蓝法[8]。

（2）脂肪测定：索氏提取法[9]。

（3）含钙量测定：EDTA络合法[10]。

（4）含磷量的测定：钼酸铵分光光度法[11]。

（5）总酸的测定。总酸测定：按GB/T 12456—2008测定，指示剂法，乳酸计[12]。

（6）含水量的测定。按GB/T 5009.3―2010测定，直接干燥法。

（7）微生物指标。菌落总数、大肠杆菌、致病菌检测：按GB/T 4789.38―2010测定[13]。

2 结果与分析

2.1 山药红牛骨肽营养粉的最佳配方优选

按照表1试验因素水平表，实施L16(44)正交试验方案，对试验结果做直观分析见表3。正交试验的结果可以看出：（1）RA＞RD＞RC＞RB，说明红牛骨粉是影响营养粉含钙量的主要因素，其次是酪蛋白磷酸肽与山药粉，果葡糖浆影响最小。（2）从各因素水平对营养粉含钙量的影响来看，在红牛骨粉的添加量中K1A＜K2A＜K3A＜K4A，说明红牛骨粉的添加量直接影响钙含量；在酪蛋白磷酸肽添加量中，K1D＜K2D＜K3D＜K4D，说明酪蛋白磷酸肽添加量越多，含钙量越高；在山药粉添加量中K3C＜K1C＜K4C＜K2C，说明山药粉添加量30 g最好；在果葡糖浆添加量中，K3B＜K1B＜K2B＜K4B，果葡糖浆添加量对营养粉含钙量影响不大。（3）由K值可知最佳工艺组合为A4B3C2D4。

表3 正交试验结果分析表

试验组因素钙含量/mg·(100 g)-1A红牛骨粉/gB果葡糖浆/gC山药粉/gD酪蛋白磷酸肽/g 1 1(20) 1(10) 1(25) 1(1) 7 833.51 2 1(20) 2(15) 2(30) 2(2) 8 345.70 3 1(20) 3(20) 3(35) 3(3) 8 792.33 4 1(20) 4(25) 4(40) 4(4) 9 567.88 5 2(25) 1(10) 2(30) 4(4) 12 778.34 6 2(25) 2(15) 3(35) 1(1) 9 366.34 7 2(25) 3(20) 4(40) 2(2) 9 578.45 8 2(25) 4(25) 1(25) 3(3) 10 233.51 9 3(30) 1(10) 3(35) 3(3) 10 665.32 103(30) 2(15) 4(40) 4(4) 13 025.67 113(30) 3(20) 1(25) 1(1) 10 786.54 123(30) 4(25) 2(30) 2(2) 10 871.23 134(35) 1(10) 4(40) 2(2) 10 566.32 144(35) 2(15) 3(35) 3(3) 11 441.79 154(35) 3(20) 2(30) 4(4) 12 454.61 164(35) 4(25) 1(35) 1(1) 11 656.09 K137 749.8841 833.4940 509.6539 642.48 K231 724.2542 182.5044 449.8840 451.47 K345 448.7641 611.9340 168.7841 035.95 K446 021.8142 328.7142 838.4147 926.50 K19 437.4710 458.3710 127.419 910.62 K27 931.0610 545.6311 112.4710 112.87 K311 362.1910 402.9810 042.1910 258.98 K411 505.4610 582.1810 709.6011 981.63 R 3 574.39179.191 070.282 071.01主次因素: A＞D＞C＞B

用A4B3C2D4组合的工艺进行了3次重复验证试验，其含钙量为12 544.21，12 459.70和12 627.55 mg/100 g，均高于处理中的最高组合A3B2C4D4，进一步验证了最佳组合为A4B3C2D4。

表4 正交试验试验方差分析表

方差来源SSfMSF显著性水平因素A3.74431.24817.561a＜0.01因素B0.38730.1124.024a＞0.05因素C1.23730.4125.922a＜0.05因素D1.78630.5959.377a＜0.01误差e0.06530.022总和T7.81915注: F0.05(3, 15)=4.10, F0.01(3, 15)=7.56

表4方差分析表明，试验中各因素对产品含钙量的影响分别为红牛骨粉、酪蛋白磷酸肽的添加量达到了差异极显著水平，山药粉的添加量达到了差异显著水平，而果葡糖酱的添加量为不显著。

2.2 益生菌发酵山药红牛骨肽营养粉的最佳发酵条件优选

三种益生菌作用于山药红牛骨粉发酵液，游离钙转化率及总酸结果分析见表5。结果表明，三种益生菌能对发酵液中结合钙进行解离，产生游离钙。四种配比因子的发酵液游离钙转化率分别为9.4%，14.3%，17.9%和20.1%，总酸度分别为66.2%，74.5%，81.4%和86.3%。显示出随着发酵液量的增加，游离钙转化率及总酸度有不同程度的增加，其中2和3水平的总酸度是口感较佳的数值。

表5 益生菌发酵营养粉结果分析

水平指标发酵液/%益生菌/片双蒸水/%游离钙转化率/%总酸度/°T 66.2 74.5 81.4 86.3 1234 40 50 60 70 1.0 1.5 2.0 2.5 60 50 40 30 9.4±0.547 8 14.3±1.865 5 17.9±0.483 2 20.1±0.233 4

2.3 益生菌发酵山药红牛骨肽营养粉主要理化评价指标结果分析

益生菌发酵山药红牛骨肽营养粉主要理化评价指标见表6。结果表明，山药红牛骨肽益生菌营养粉的水分含量低于8%，在储存过程中就不易结块和霉变，易于保存。营养粉中的蛋白质和脂肪含量分别为10.4%和6.7%，都达到了较高的水平。经检测，发酵产品中钙、磷的比例接近2∶1。菌落总数、大肠菌群符合国家食品卫生标准，致病菌未检出。

表6 山药红牛骨肽益生菌营养粉主要理化性质

项目结果限量含水量/g·(100 g)-17.23蛋白质/g·(100 g)-110.4脂肪/g·(100 g)-16.7钙/mg·(100 g)-129 537.23磷/mg·(100 g)-115 041.6菌落总数/CFU·g-190 ≤30 000大肠菌群/MPN·(100 g)-122≤90致病菌未检出

3 结论

（1）山药红牛骨肽益生菌营养粉作为高钙营养粉的活菌制剂，它是利用“平凉山药”与活牛商标“平凉红牛”骨粉为主原料，通过添加酪蛋白磷酸肽与果葡糖浆以增加产品的蛋白质含量与风味。正交试验显示，红牛骨粉添加35%，果葡糖浆添加20%，山药粉添加30%，酪蛋白磷酸肽添加4%，未经发酵的产品的含钙量可以高达12 627.55 mg/100 g，是人们理想的补钙制剂。

（2）三联益生菌发酵山药红牛骨肽益生菌营养粉，主要是利用三联活菌片（金双歧）发酵营养粉，使游离钙离子的数量极大增加，提高人体钙、磷联合吸收率。发酵采用小培养法，发酵液培养选用SNJA10K5智能密封八分杯酸奶机，置于紫外线灯下，37℃，24 h振摇培养，试验结果显示：发酵产品游离钙转化率可达到17.9%及20.1%，口感较佳的总酸度数值（乳酸计）81.4%、86.3%，发酵的产品的含钙量可以高达29 537.23 mg/100 g。

（3）山药红牛骨肽益生菌营养粉的主要理化指标均达到了国家食品卫生标准。山药红牛骨肽益生菌营养粉的水分含量低于8%，在储存过程中不易霉变，易于保存。经检测，发酵产品中钙、磷的比例接近2∶1的水平。试验所得益生菌营养粉中此两种元素正是人体所能吸收的最佳比例。因此能同时起到补充钙、磷元素的要求。是极具开发前景的一项补钙活菌制剂。