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LncRNA (Long noncoding RNAs, lncRNAs)长链非编码 RNA，目前一般定义转录长度>200nt的非编码RNA为LncRNA。LncRNA起初被认为是基因组转录的不具有生物学功能的“噪音”，只是 RNA 聚合酶II转录的副产物。 随着近年来各类LncRNA被大量发现，LncRNA被证实参与了细胞内多种重要的调控过程，最近LncRNA研究更是成果不断，例如2017年5月4日，Cell杂志在线发表了中科院生化与细胞研究所陈玲玲课题组题为“SLERT Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription”的关于LncRNA的最新研究成果，该成果揭示了细胞核仁里LncRNA SLERT 在RNA聚合酶I转录过程中的重要功能和作用机制，这是首次在人类细胞中发现可以调控RNA聚合酶转录的LncRNA。 与LncRNA研究成果频出相对应的是，近几年有关LncRNA研究的国自然立项数连年增长，2016年261项，2017年更是达到了345项。LncRNA的相关研究也逐渐成为了当今生命科学最热门的研究领域之一。 本文先介绍当前最热门的LncRNA功能研究--ceRNA LncRNA的ceRNA作用模式：LncRNA作为竞争性内源RNA(ceRNA)，与miRNA 结合，在细胞中起到miRNA海绵的作用。从而降低miRNA的活性，间接上调miRNA相关靶基因的表达。 话不多说，直接上图 基于ceRNA调控机制的 LncRNA系统研究思路 接下来我们选择了2017年6月28日在线发表在Molecular Cancer的一篇发现并研究LncRNA MRCCAT1在肾透明细胞癌的作用和机制的文章，通过解读此文来讲述LncRNA研究方法。 点击文末“阅读原文”获取该论文 1.选择LncRNA并确认其可作为独立的临床预后因子 作者通过对转移性肾透明细胞癌（ccRCC）与非转移性肾透明细胞癌组织进行LncRNAs芯片分析，发现了一个新的LncRNA，命名为MRCCAT1，在ccRCC组织中显著高表达并与ccRCC的迁移能力相关。体外实验证明过表达MRCCAT1促进ccRCC细胞的增值、迁移和侵袭，敲低MRCCAT1抑制ccRCC细胞的增值、迁移和侵袭，同时体内实验验证了敲低MRCCAT1抑制ccRCC的转移。机制上，MRCCAT1通过招募PRC2到NPR3启动子位置来抑制NPR3的转录，进一步激活p38-MAPK信号通路。因此，MRCCAT1可以作为ccRCC病人的一个预后诊断生物标记和治疗ccRCC的靶标。 2.功能验证实验 为了研究MRCCAT1在ccRCC中的作用，作者首先通过体外实验向两个ccRCC细胞系into786-O与 Caki-1中转染MRCCAT1 shRNA 来敲低MRCCAT1的表达，发现敲低MRCCAT1的表达后into786-O与 Caki-1的细胞增值能力、划痕愈合能力、细胞侵袭能力均受到显著抑制。同时，在into786-O与Caki-1细胞系中过表达MRCCAT1，发现细胞增殖，迁移能力，侵袭能力均增高。以上敲低与过表达实验证明MRCCAT1可以增强ccRCC的侵袭转移能力。 3.小鼠动物模型实验 为了检测MRCCAT1对体内ccRCC转移的作用，作者将稳定敲低MRCCAT1且表达荧光素酶的786-O肿瘤细胞稳转株通过尾静脉注射建立了肺转移小鼠模型。与对照组相比， MRCCAT1敲低组的荧光强度明显降低。并且6周后，MRCCAT1敲低组裸鼠的肺转移损伤更少、更小。这些结果表明MRCCAT1在体内可以促进肾透明细胞癌的肺转移。 作者通过分析LncRNAs-mRNAs共表达网络预测发现MRCCAT1与NPR3的表达呈负相关。随后在68例临床ccRCC样本中，通过Q-PCR进行验证，发现与预测结果一致。然后Q-PCR和Western Blot结果发现，在MRCCAT1敲低的into786-O与Caki-1细胞系中，NPR3 的mRNA明显增加，在MRCCAT1过表达的into786-O与Caki-1细胞系中，NPR3 的mRNA明显下降。同样，在MRCCAT1敲低的肺转移肿瘤中NPR3的表达也提高。以上结果表明在ccRCC细胞中MRCCAT1可以抑制NPR3的表达。同时作者发现过表达NPR3，可以逆转MRCCAT1对肿瘤细胞的增殖作用。提示MRCCAT1是通过抑制NPR3的表达来促进转移性肾透明细胞癌的转移过程。 4.机制研究 已知研究中NPR3通过负调控MAPK信号通路参与肿瘤的增殖以及转移。为了验证在ccRCC的转移侵袭过程MRCCAT1是否参与MAPK信号通路，作者检测了了ERK, p38 and JNK的磷酸化水平，发现在过表达MRCCAT1细胞系中，磷酸化的p38升高，但同时过表达NPR3后，磷酸化的p38降低。细胞侵袭实验也证明，使用p38-MAPK抑制剂SB203580可以逆转MRCCAT1造成的细胞侵袭增强现象。这些结果表明MRCCAT1通过抑制NPR3的表达，激活p38-MAPK信号通路参与肾透明细胞癌的转移侵袭过程。 为了研究MRCCAT1调控NPR3的具体机制，作者进行通过分离细胞核、细胞质蛋白，发现MRCCAT1主要定位于细胞核。最近研究发现LncRNA在细胞核内可以通过招募多梳蛋白家族调控基因的表达。在人类所有的LncRNA中，有20%的lncRNA可以与多梳抑制复合体PRC2结合，其组成包括SUZ12, EED, EZH1/2 (H3K27 甲基转移酶)和RbAp16/48，该复合体通过诱导H3K27的三甲基化来抑制基因的转录。因此作者预测MRCCAT1是通过这种方式抑制NPR3的表达。通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验发现EZH2与MRCCAT1结合，进一步的染色质免疫沉淀（CHIP）实验发现MRCCAT1可以增加EZH2与H3K27me3在NPR3启动子区域的结合。表明MRCCAT1是通过结合EZH2来抑制NPR3的转录。 综上所述，MRCCAT1在促进ccRCC细胞转移过程中扮演重要的角色，其机制主要是通过负调控NPR3的表达和激活p38-MAPK信号通路来促进癌细胞增值、转移。MRCCAT1可以作为ccRCC病人临床结果的一个独立的预测因子。基于这项研究，MRCCAT1可以作为一个潜在的治疗靶标来抑制ccRCC的发展。 最后总结该文章研究思路：通过芯片找到差异表达的分子，验证并确定其定位，通过多种方法确认其是没有编码能力的LncRNA，通过临床数据分析，确认该LncRNA有研究价值，然后进行功能验证实验以及细胞水平和动物水平实验，最后做机制研究，通过LncRNAs-mRNAs共表达网络找到相关mRNA，并联系上信号通路。 下期预告 1.环状RNA（circRNA）研究方法及典型文章分析 2.近两年生物/医学领域国人发文最多的6-10分期刊盘点
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