革兰阴性杆菌对抗菌药物的耐药机制仍然是大家非常熟悉的产生灭活酶、靶位改变及外排泵高表达等，产ESBLs的革兰阴性菌对第三代和第四代头孢菌素的耐药问题仍是我们必须面对的且非常突出的问题，但近年大家主要关心的革兰阴性菌的耐药机制如下。
1．碳青霉烯类抗生素的耐药机制：碳青霉烯类抗生素耐药最主要的机制是产生碳青霉烯酶，造成包括碳青霉烯类抗生素在内的几乎所有β－内酰胺类抗生素耐药，主要包括金属酶(metallo－beta－lactamases，MBL)、KPC酶(carbapenemases－producing Klebsiella pneumoniae，KPC)和OXA酶(oxacillinase酶)等。
金属酶：其酶活性中心需金属锌离子的参与，故称为金属β－内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，可由染色体、质粒或转座子介导。该类酶对β－内酰胺酶抑制剂敏感性差，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。随着临床碳青霉烯类抗生素使用的增加，MBL的产生有不断上升的趋势。根据氨基酸的同源性，Bush分类中将金属酶分为B1、B2和B3亚型，其中B1亚型包括了大多数已知的金属酶，如常见的IMP、VIM和NDM等。自1991年日本首次发现产IMP－1的铜绿假单胞菌以来，世界各地不断发现IMP的其他亚型，迄今为止已超过50种，其同源性较高，多数由IMP－1突变产生[6]。临床上IMP主要从铜绿假单胞菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌中分离得到。除小部分blaIMP－1基因存在于Ⅲ类整合子，绝大多数blaIMP－1基因位于Ⅰ类整合子上，整合子通过质粒或转座子等可移动元件进行传播，从而导致耐药基因在细菌中的播散。同样可通过整合子机制在不同种细菌间进行水平传播的VIM，十几年来已发现近50种亚型，大多分离自铜绿假单胞菌，遍及亚洲、欧洲、北美洲和南美洲各地，给临床治疗带来严重的威胁。2008年，瑞典报道了第1例NDM－1病例，此后，其突变亚型相继被报道。NDM－1大多存在于肠杆菌科，也存在于非发酵菌和弧菌科等。与已知的MBL有所不同，NDM酶活性位点附近具有独特的氨基酸残基以及插入序列，能与碳青霉烯类抗生素更紧密接合。产NDM的菌株同时对多类抗菌药物均表现为耐药，与其同时携带的多种耐药基因密切相关。研究结果显示，大多数blaNDM－1阳性的菌株同时携带blaCMY、blaTEM、blaSHV或blaCTX－M型β－内酰胺酶基因，以及ara－2、ereC、aadA1和cmlA7等多种其他耐药基因。大多数研究结果显示，blaNDM基因定位于质粒上，并能以质粒为转移元件，通过接合在不同菌种间转移，这就是导致blaNDM基因能在遗传背景差异显著的不同菌种中存在的重要原因之一。blaNDM－1基因可位于不同类型的质粒上，如IncR、IncX3、IncF、IncL/M和A/C等，调查结果显示，blaNDM－1基因的传播与特定的克隆、具体的质粒和单独的基因结构均无关。
KPC型碳青霉烯酶：其在分子分类上为A类，功能分区上属于2f组，是一种由质粒介导的β－内酰胺酶。KPC型碳青霉烯酶利用丝氨酸残基的活性，具有非常广泛的水解活性，包括青霉素类、头孢菌素类、经典的β－内酰胺酶抑制剂(克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦)、氨曲南和碳青霉烯类抗生素，该酶的活性可以部分被克拉维酸抑制，但不被EDTA所抑制。KPC型碳青霉烯酶是目前引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因，尤其在碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌中最为常见[7]。2001年由Yigit首次报道KPC－1后，迄今共发现了24种亚型(KPC－1～24)，但在随后的研究中发现KPC－1的序列与KPC－2完全相同，故KPC型碳青霉烯酶至今共有23种亚型，每个亚型与KPC－2型相比，只有1～5个氨基酸的替换。在全球的流行病学调查中发现，KPC－2与KPC－3是主要的亚型。美国疾病预防与控制中心对其国内各州产KPC酶的肺炎克雷伯菌进行分型后发现，主要克隆型为ST258；国内也有类似的研究，结果显示我国的主要流行克隆型为ST11，ST11与ST258仅有1个管家基因的差别，属于同一个克隆复合体CC258。KPC型碳青霉烯酶容易传播和播散的原因在于该基因质粒周围结构的特殊性。2008年，Nass报道KPC基因位于1个名为Tn4401的转座子结构上，这个转座子包含了1个转座酶tnpA基因和1个熔解酶tnpR基因，还有2个插入序列ISKpn6和ISKpn7，KPC基因就位于这2个插入序列中间。Shen等[8]在2009年首次报道我国KPC基因周围有着不同于Tn4401的结构，即KPC基因位于1个由Tn3转座子与Tn4401转座子共同整合而成的复杂结构上。KPC基因可以依靠两边的插入序列随着转座子在不同菌种中快速传递。
与KPC型碳青霉烯酶在Bush－Jacoby－Medeiros分类中同为2f组的β－内酰胺酶还有SME和IMI等。SME酶在黏质沙雷菌中特异性存在，基因定位在细菌的染色体上，该基因存在5种亚型(SME－1～5)，每个亚型之间仅有1～2个氨基酸的变异，产SME型碳青霉烯酶的细菌主要在英国分离。IMI酶存在11种亚型(IMI－1～11)，并在阴沟肠杆菌与阿氏肠杆菌中发现，在阿氏肠杆菌中IMI－2基因位于Tn2501转座子上，其包含了插入序列IS2与转座酶tnpA，而在阴沟肠杆菌中IMI－2基因位于转座子Tn903上，这些转座结构可能与IMI基因在染色体与质粒上的移动相关。
OXA型碳青霉烯酶：D类β－内酰胺酶亦被称作OXA酶，因早期发现的OXA酶对苯唑西林的水解速度比典型的青霉素快而得名，但如今更多的是根据酶的氨基酸结构进行归类。根据功能分类，OXA酶属于2d组，大部分此类酶的活性可被NaCl而不能被克拉维酸抑制。不同的OXA酶的水解谱各有差异，如功能分类2de亚组的OXA酶属于ESBLs，而2df亚组的OXA酶具有水解碳青霉烯类抗菌药物的活性，但较弱，OXA型碳青霉烯酶的传播与碳青霉烯耐药性的不断升高有着密切的关系，尤其是在不动杆菌属细菌中。研究结果显示，CRAB的主要耐药机制是产OXA－23型碳青霉烯酶[9]。目前，在统计各种β－内酰胺酶数据的Lahey网站(G. Jacoby and K. Bush, http：//www.lahey.org /Studies/)上，已报道过的OXA酶超过400多种。根据对这些OXA酶氨基酸序列进行最大相似度分析，可将具有碳青霉烯酶活性的OXA酶归为12类，分别是OXA－23－like、OXA－24/40－like、OXA－48－like、OXA－51－like、OXA－55－like、OXA－58－like、OXA－134－like、OXA－143－like、OXA－211－like、OXA－214－like、OXA－229－like以及OXA－235－like碳青霉烯酶。值得注意的是，以OXA－23型碳青霉烯酶为代表的10类OXA酶常出现于不动杆菌属细菌中，而以OXA－48型碳青霉烯酶为代表的另外2类酶则出现于肠杆菌科细菌以及希瓦菌属细菌中，这两大类酶的氨基酸序列差异较大，OXA－23与OXA－48酶的氨基酸序列相似度仅为39%。
2．替加环素的耐药机制：目前研究认为，外排泵在替加环素耐药过程中发挥重要作用，尤其与RND型外排泵相关。RND型外排泵主要存在于革兰阴性菌中，在革兰阴性菌的天然耐药和获得性耐药中扮演着重要角色。在肠杆菌科细菌中与替加环素耐药相关的RND型外排泵则有AcrAB－TolC和OqxAB[10]，在鲍曼不动杆菌中则包括AdeABC、AdeFGH和AdeIJK等[11]。进一步的研究发现这些外排泵的表达又处于多种转录调控因子的调控之中。目前，RND型外排泵系统过表达及其调控基因突变在替加环素耐药中的作用已经得到广泛验证。
最近的研究发现，核糖体蛋白的变异可能也是引起细菌对替加环素耐药的重要原因。Beabout等[12]将鲍曼不动杆菌、屎肠球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌培养于带有一定浓度的替加环素的培养基中，在最后获得的替加环素适应株中发现，47株中有35株存在rpsJ基因的突变(编码核糖体S10蛋白)，进一步的研究发现rpsJ基因的突变可以导致屎肠球菌对替加环素的MIC值提高至临床折点0.5 μg/ml，这也是第一次关于rpsJ基因突变导致细菌对替加环素敏感度下降的报道。在随后的报道中Lupien等[13]证明了核糖体S10蛋白的突变可导致肺炎链球菌对替加环素的敏感度降低。
以往的研究结果显示，替加环素能够克服引起细菌对四环素耐药的机制，而最近的研究发现，携带tetA基因的沙门菌除对四环素耐药外，同样也对替加环素耐药。Linkevicius等认为，tetA的突变进化可以引起大肠埃希菌对替加环素敏感度的下降，同时他们认为核糖体保护蛋白TetM和四环素修饰酶TetX的突变也可导致替加环素敏感度的下降。
3．多黏菌素的耐药机制：目前细菌对多黏菌素耐药的机制仍未完全明确，主要包括染色体介导和质粒介导的两大类耐药机制。染色体介导的耐药机制中，最重要的是对脂多糖核心及其脂质A的修饰，具体包括有磷酸乙醇胺(PEtN)、4－氨基－4脱氧－L－阿拉伯糖(L－Ara4N)的共价结合以及pagP酶介导的脱酰化和羟基化等。对脂多糖最常见的修饰方式是其带正电荷的磷酸基被4－氨基－4脱氧－L－阿拉伯糖(L－Ara4N)替换，从而使脂质A的负电荷降低至0；另一种常见的修饰是与磷酸乙醇胺(PEtN)的共价结合，能够使脂质A的净电荷由－1.5降低至－1。此外，还有外排泵的过表达、细菌荚膜多糖阻断等方式来产生对多黏菌素的耐药。
在对脂多糖的修饰机制中，双组分调控系统(TCS)具有重要的意义，它们可以受环境刺激以及双组分调控系统内的特殊基因突变所触发，从而使其对脂多糖修饰基因持续的激活和过表达。双组分调控系统中PhoP/PhoQ、PmrA/PmrB两组具有最重要的意义，PmrA/PmrB的表达增加会导致操纵子pmrCAB和arnBCADTEF－pmrE的表达增加，它们分别介导了细菌对PEtN和L－Ara4N的合成与传递。而双组分调控系统PhoP/PhoQ导致多黏菌素的耐药主要是通过增加双组分调控系统PmrA/PmrB的表达，实现对脂多糖的修饰。在不同的菌种中，不同种类双组分调控系统影响着多黏菌素的耐药水平。
肠杆菌科细菌中，对脂多糖修饰的最重要的双组分调控系统PmrA/PmrB(PhoP/PhoQ可通过增加PmrA/PmrB的表达实现)，可受外界环境刺激的影响，包括异常的pH值、Fe3＋、Mg2＋浓度及多黏菌素的暴露等，导致一系列与脂多糖修饰相关基因表达水平出现变化。在大肠埃希菌中，除双组分调控系统PmrA/PmrB和PhoP/PhoQ对多黏菌素耐药的发生具有重要意义外，一种酪氨酸激酶Etk也可以促进L－Ara4N对脂多糖的修饰，形成对多黏菌素的耐药。Etk酶可促进Ugd(pmrE)脱氢酶的活性，从而促进L－Ara4N合成起始原料的合成(Ugd－glucuronic acid)。mgrR是另一个可以调节多黏菌素耐药的基因，是一种小RNA，受双组分调控系统PhoP/PhoQ调控，能够抑制性调解eptB，而后者可以介导外膜脂多糖上的Kdo残端与PEtN的结合，从而减少脂多糖的净电荷。
在产KPC的肺炎克雷伯菌中，多黏菌素耐药的一种重要机制是mgrB基因的失活。mgrB基因是一段长度为144 bp、编码1个含47个氨基酸的跨膜蛋白的基因，对PhoP/PhoQ系统具有负反馈调节作用，将导致PhoP/PhoQ相关基因表达受到抑制。当mgrB因发生插入失活、无义突变或者大片段的缺失而无法正确表达时，双组分调控系统phoP/phoQ的表达将增加，从而导致肺炎克雷伯菌对多黏菌素的耐药。除此之外，也有研究发现肺炎克雷伯菌中有新的双组分调控系统CrrA/CrrB，可导致对多黏菌素的耐药，同样是通过对脂多糖的修饰产生耐药。
目前，鲍曼不动杆菌对多黏菌素的耐药主要有两大主要机制，一是通过PEtN对脂多糖的修饰，其分子机制是双组分调控系统PmrA/PmrB发生突变导致表达持续的增加，而鲍曼不动杆菌并不存在L－Ara4N合成的分子机制，其对脂多糖的修饰仅通过PEtN进行，多种pmrA/pmrB中导致该双组分调控系统持续表达的突变已被发现，可以导致对多黏菌素耐药。另一种机制则是通过在脂多糖合成基因上发生突变或插入失活所导致的脂多糖完全丢失，包括lpxA、lpxC以及lpxD，临床上已经出现该原因导致的耐药菌株。
铜绿假单胞菌与鲍曼不动杆菌不同，其含有PmrA/PmrB、PhoP/PhoQ两对双组分调控系统，可通过PEtN和L－Ara4N对脂多糖进行修饰，与肠杆菌科十分相似。除此之外，铜绿假单胞菌中另有3对双组分调控系统参与了多黏菌素的耐药，分别是ColR/ColS、CprR/CprS和ParR/ParS。
质粒介导的耐药机制：在2015年底，质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr－1首次被报道[14]。该质粒最早在中国畜牧业中发现，mcr－1是一段长度为1 626 bp的基因，GC含量为49%，其表达产物是一种磷酸乙胺醇乙醇胺转移酶，可通过使脂质A结合PEtN达到对多黏菌素的耐药。
对临床菌株的筛查结果显示，在亚洲、欧洲、非洲及美洲等地均有携带mcr－1的肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌的临床菌株出现。更为重要的是，体外实验结果显示不同菌种之间携带mcr－1的质粒可以通过结合或转化试验在细菌间传递。虽然目前临床菌株中未发现携带mcr－1的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌，但体外研究结果已经证实被转化进入非发酵菌中的mcr－1基因也可表达并引起对多黏菌素的耐药。
