侠士！看你骨骼清奇，慢病毒感染秘籍赠你可否？

路漫漫其修远兮，吾将上下而求索！

#

首卷语

慢（需要长时间培养）病毒（将外源基因整合到宿主染色体）

使感染细胞持久性表达外源目的基因；

对于较难转染的多种细胞，提高转染效率

（难转细胞：神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞、非分化细胞等，其实就是大部分非肿瘤细胞）

#

废话不多说，接秘籍！

秘●籍

认真修炼 方成大牛

好啦，秘籍拿好

大家开始修炼吧！

·

对，我没开玩笑，就这两张图！

·

好吧好吧

来看注解版

一

如何添加最优化的慢病毒量？确定靶细胞 MOI 值

MOI（Multiplicity of Infection, MOI）：细胞的最佳感染复数。

滴度：表示每毫升可成功转导目的细胞的基因组数。单位：TU/mL （「TU」为「Transduction Units」的缩写）

MOI = 应用慢病毒数（TU） / 被感染细胞数（个）

即：当成功感染时（使 80% 以上细胞达到转导目的时），应用 10^6 TU 慢病毒感染 10^6 个细胞可成功，MOI=1；如需要以 5 × 10^6 TU 病毒才可成功感染 10^6 个细胞，则 MOI = 5。

如何确定目的细胞的 MOI 值?

慢病毒对不同类型细胞的 MOI 各异。

下表是 GeneCopoeia 通过实验摸索得出的多种细胞系的 MOI 参考值。

根据上表，若您的实验对象是乳腺癌细胞系 MCF-7，其最佳 MOI 参考值= 2，那么当您购买了 50μL 的慢病毒颗粒（滴度是 10^8 TU/mL）时，您得到的慢病毒总量为 5×10^6TU。

在 MOI= 2 的条件下，您所购买的慢病毒足够转导 MCF-7 在 24 孔板中铺板培养的其中 5 孔（约合 4×10^5 细胞/孔）。

若您的目的细胞系 MOI 要求较高，您需要购买或自行包装更多慢病毒颗粒。

以上为预估值，

不要偷懒，

用梯度MOI （如：MOI = 0.3, 1, 3, 5, 10, etc.）分别感染等量细胞，确认其 MOI 值。

（见图 1）

图 1. 梯度稀释慢病毒颗粒，摸索细胞最佳 MOI 值

简述步骤（以H1299细胞为例）：

1. 96 孔板铺板培养目的细胞过夜；

2. 以 10 倍梯度稀释慢病毒并分别进行转导

3. 72 小时后以荧光显微镜观察 GFP 报告基因表达情况，确定该细胞在最佳转导效果下的慢病毒量。

获得较高的 MOI 值方法：

1. 加入 polybrene (hexadimethrine bromide), 一种能够减少病毒与细胞膜间电荷排斥作用的阳离子聚合物

2. 使用能够捕获慢病毒颗粒的磁珠（例如，利用磁珠可成功地将 MM-AN 细胞的 MOI 从 16 降到 4）。

· 建议 ：选择载体骨架上带有标记基因（如：Puromycin, Neomycin 等）的克隆，可方便后续进行药物筛选，建立将目的基因成功地随机整合到特定细胞的稳定细胞株。

二

慢病毒感染目的细胞实验步骤

1. 感染预实验——24孔培养板为例

实验材料：工具细胞 293T（人胚肾上皮细胞）、H1299（人肺癌细胞）或其它细胞；培养基；24 孔培养板；移液枪；枪头；EP 管；细胞计数板；冰盒；废液缸等。（根据目的细胞情况，可酌情使用 Polybrene）

Day1：准备细胞
培养细胞至生长对数期——消化计数——接种 5×10^4 个细胞/孔，添加细胞培养液至 500µL。

* 通常情况下，该接种量的 H1299 或 293T 细胞在感染后第 3 天可生长至 80%-90% 融合度。（接种目的细胞时，请根据细胞的实际生长速度调整接种量，使目的细胞感染后第 3 天生长至 80%-90% 融合度）

Day2：慢病毒感染细胞
（1）准备慢病毒颗粒：计算所需慢病毒颗粒的量，将冻存在 -80℃ 的慢病毒颗粒取出，冰浴融化；
（2）感染目的细胞：在显微镜下观察细胞生长状态及细胞融合度；如细胞状态较好，则开始实验：
A. 用移液枪小心吸去 24 孔板中的旧培养液，加入新的完全培养液；
B. 在细胞中分别加入计算好的慢病毒颗粒液，将培养板平置于工作台上，以划 8 字的方式轻柔混匀；
C. 混匀后，细胞培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，过夜培养。

Day3：更换培养液
感染 12-16 小时后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，重新向培养板添加含 5% 灭活 FBS（胎牛血清）的培养液，继续培养。（目的细胞需要调整感染时长，部分细胞不可感染超过 12 小时。）

Day4：观察细胞状态
继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常。

Day5：观察（评估）慢病毒颗粒感染效率

盖紧 24 孔培养板，使用 70% 乙醇清理培养板外壁，在倒置荧光显微镜观察荧光，拍照并估计慢病毒颗粒对细胞的感染效率。（如果慢病毒颗粒携带的基因表达所需的时间较长，荧光表达所需时间也较长，建议感染 72、96 小时后观测荧光表达。）

根据荧光情况，可以初步从 MOI 梯度摸索实验中，找出最适合目的细胞的 MOI 值。 

图 1. H1299 细胞的 MOI 梯度摸索结果示例

示例中使用的慢病毒颗粒：LPP-eGFP-Lv105（滴度 1×10^8TU/mL）

曝光时间：1s

显微倍数 ：100×

第 2 组细胞的感染效率已达到 90%。

当 MOI 值过高时，继续添加慢病毒颗粒，感染效率没有明显增加，且细胞状态容易变差、皱缩甚至死亡。

敲黑板！

荧光报告基因和目的基因的相对表达并不总是成等比关系的，

建议使用 qRT-PCR 作进一步鉴定。

* 在有的情况下，即使荧光报告基因表达较低或无表达，目的基因依然能够表达；反之亦然。

2. 摸索细胞的最适药物筛选浓度

细胞的种类与状态均会影响慢病毒颗粒转导效率，部分细胞可能与慢病毒颗粒有相互抵抗的现象，导致感染效率低。

当您在感染后 72、96 小时后发现感染效果仍不理想，

建议对感染后的细胞进行药物筛选（药筛）。

* 慢病毒颗粒携带的基因整合到目的细胞基因组是随机发生的非同源性重组，当抗性基因表达时，目的基因不一定也能表达，在进行药筛处理后，还要以qRT-PCR 作进一步鉴定。

* 在进行正式的抗生素筛选前，建议您先对空白细胞的最小致死浓度进行摸索、优化。

表 4. 抗生素筛选细胞的相关参考值

表 5. 药物筛选浓度梯度参考（Puromycin）

* 表格中使用的 Puromycin 浓度为 10 µg/mL，是由 10 mg/mL 的 Puromycin 母液以细胞培养液稀释 1000 倍所得。

简述步骤（以 293T 细胞+Puromycin 为例）：

* 查文献知：Puromycin 对 293T 细胞的最小致死浓度为 2 µg/mL。在 2 µg/mL 附件多设置几个浓度梯度，可以得出较精确的的筛选浓度。

1. 准备 24 孔培养板，按每孔 1-5×10^4 细胞数 (约等于 20%-35% 融合度) 接种 293T 空白细胞，对其中 6 个孔进行铺板；

2. 一般 Puromycin 母液的浓度是 10 mg/mL，用细胞培养基将 Puromycin 母液稀释 1000 倍，可获得终浓度为 10 µg/mL 的 Puromycin 稀释液；

3. 按表 5 所示，每孔添加相应的细胞培养基和 Puromycin；

4. 24 孔培养板置于 37℃、5% CO2 培养箱，培养过夜；

5. 按表 4 的药筛时间和观察时间建议，定期在荧光显微镜下观察细胞状态。

当空白细胞刚好能全部死亡时，该浓度的抗生素可作为最适药筛浓度。

注：以上表格的设置仅供参考。

通常即使细胞一样，由于培养的条件和传代次数不一样，筛选浓度亦不一样。可根据试验结果进行更进一步的细化浓度梯度设置。

如果药筛过程中细胞量较少，一般不换液，只有在稳转株药筛过程中，根据细胞生长速度，3-4 天换液一次。

*目的细胞较难感染如何实验：

如果一次感染不能达到预期效果时，在感染 3 天后可对目的细胞进行药筛处理，获得较多被感染的细胞，如以下例子所示：

图 3. 人食管癌细胞 CE-81T（贴壁细胞）的药筛前后效果对比 

图 4. 人骨肉瘤细胞 Hos（贴壁细胞）的药筛前后效果对比 

图 5. 人白血病 K562（悬浮细胞）的药筛前后效果对比 

附：细胞融合度参考

图 6. 293T 细胞在不同融合度的明视野效果（放大倍数：100×）

3. 实验体系的放大和正式实验：

根据预实验结果，

放大慢病毒颗粒细胞感染实验，

实施正式实验。

按底面积放大（适用于贴壁细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和底面积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和底面积成正比。

假设预实验使用 96 孔板（底面积 0.3cm²），使用 1 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×10^8 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（底面积 10 cm²），则：

底面积的放大倍数 ≈ 33
正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×33 = 33 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×10^8 TU/mL）

注：请确保细胞均匀、单层分布，不成簇生长。

按培养体积放大（适用于悬浮细胞）
当细胞的密度不变时，细胞总数和感染体积成正比，且 MOI 不变，所需慢病毒颗粒用量也和培养液体积成正比。

假设预实验使用 96 孔板（培养体积 100μL），使用 1 μL 慢病毒（滴度 1×10^8 TU/mL）可成功感染细胞；如正式实验使用 6 孔板（培养体积 2 mL），则：

培养体积的放大倍数 = 20

正式的慢病毒颗粒用量 = 预实验用量×20 = 20 μL 慢病毒颗粒（滴度 1×10^8 TU/mL）

注：请确保细胞生长状态良好。