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背景 ‘Who is doing what’ 是微生物生态学领域及其重要的问题。16S rRNA基因测序技术解决了“Who”，鸟枪宏基因组学技术可以部分解决“What”。但是将两者联系起来十分困难。目前将系统发育和功能结合的主要方式是单细胞流式细胞仪筛选+全基因组扩增+扩增子高通量测序。但是这种方法在通量、试剂成本及实验室配置上仍存在较大的制约。基于此问题，2016年一篇ISME介绍了一种廉价的、高度并行的、高通量的方法来探究任意一个微生物群落中Who is doing what——epicPCR。
原理 epicPCR全称Emulsion, Paired Isolation and Concatenation PCR，其目的是同时探究单个细胞内的特定功能基因和系统发育的标记基因 (16S rRNA基因)。其方法结合了细胞分离、封装与扩增。epicPCR基本原理如图1-3所示。 (1) 乳化的方法能够将大块的反应分割成数以百万个个体的反应，每一个反应都在一个小液滴中进行。这种方法在454和Ion Torrent测序平台已经得到了应用。乳液产生5亿左右的液滴，每个大概一纳升，每个液滴只包含一个细胞。细胞的装载和扩散符合Poisson统计量，因此平均下来100个液滴中包含的细胞数小于1。每个包含细胞的液滴都含有丙烯酰胺单体，能够聚合并封装细胞，形成聚丙烯酰胺珠。聚丙烯酰胺珠为细菌核糖体和质粒提供支持，并可以允许酶和引物进入。聚丙烯酰胺珠的直径大概在5-30um，大多数的是10um。接下来乳液被破坏，丙烯酰胺珠中的细胞经过酶处理破坏细胞壁、细胞膜和蛋白质，将基因组DNA暴露出来。 (2) 二次乳化，通透的细胞与融合PCR (fusion PCR) 组分一起重新被封装在乳液中。融合PCR在第二次乳化过程中进行，融合扩增只会在一个具有目的功能基因的给定细胞的乳液中形成。反应体系被聚丙烯酰胺珠封装，保持每个反应的独立性。首先线性扩增16S（R2），同时指数形式有限次循环的扩增功能基因（F1和R1-F2’）。有限次的扩增功能基因使用一个单端带一个突起的引物 (R1-F2’)，该引物可与16SrRNA基因连接。当这种带有突起的引物消耗殆尽，两部分将会连接在一起继续进行指数扩增（F1 and R2）。 (3) 然后利用巢式扩增，加上Illumina的adapters。热启动酶会阻止融合产物的延伸，保持单细胞的特异性。接下来blocking primers将会移除部分融合的产物。此步骤将会保留融合PCR的信息同时保持高通量。 (4) 乳液破碎之后，融合产物就可以进行高通量测序。得到的序列是来自同一个细胞的目的功能基因和16S rRNA基因的串联体。 图1 epicPCR基本原理 图2 融合PCR示意图 A．首先利用F1和R1-F2’指数扩增功能基因，同时利用R2线性扩增16S基因。R1-F2’在目的基因片段上加一个突起，可以与16S rRNA基因连接。F1和R2过量，所以R1-F2’在开始的若干轮PCR中被消耗。当R1-F2’被消耗，功能基因上的突起会接触到16S基因，形成融合产物。融合产物再被F1和R2呈指数扩增。本文中F1和R2的浓度是1 μM, R1-F2′ 浓度是10 nM。 B．巢式PCR，加上Illumina测序的adapters。 C．功能基因和16S基因融合PCR的设计。第一行是原始设计，第二行是巢式反应的设计。 D．dsrB and the 16S rRNA gene的设计。 图3 乳液中的细胞。A. 单个细胞被分散到单个液滴中。大部分液滴是空的。B．聚丙烯酰胺珠在第二轮乳化过程中携带细菌核糖体，作为融合PCR的模板。图中荧光显示的是聚丙烯酰胺珠中的细菌基因组，悬浮在乳化油中。 结果 考察了淡水湖中的硫酸盐还原菌群落多样性。选择的功能基因为sulfate reductase gene dsrB。硫酸盐还原过程是微生物在缺氧环境中利用硫酸盐作为代谢过程的最终电子受体。分别取2m和21m的水样。 图4 通过16S rRNA基因与随机barcode或者dsrB基因的融合考察epicPCR的特异性。阴性对照是聚丙烯酰胺珠与mock-16S扩增子。在epicPCR中barcode融合的出现信号，而与dsrB基因融合的没有信号。阳性对照是聚丙烯酰胺珠与mock-16S和聚丙烯酰胺珠与mock- dsrB扩增子。在epicPCR中与barcode和dsrB融合的都产生信号。环境样本中，barcode-16S组合在2m和21m都检测到16S rRNA基因的信号。而硫酸盐还原发生在厌氧环境，所以dsrB -16S组合只在21m检测到信号。 应用 Epic-PCR通量高且非常廉价，与构建一次基因组文库价格相当，可运用于鉴定功能群落、追踪水平基因转移、记录细胞之间的相互作用关系、研究物种驱动的生物地化循环、抗生素抗性基因等。
不足之处 由于扩增效率和液滴大小不是线性关系，目前产生的只是定性数据，而不能准确的定量。研究者也在不断改进此方法，希望将来能够得到定量的结果。 参考文献 1. Spencer, S.J., et al., Massively parallel sequencing of singlecells by epicPCR links functional genes with phylogenetic markers. IsmeJournal, 2016. 10(2): p. 427-436. |
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