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各位医药界的大神们好，我是一个第三方公司里一个小小的分析工程师，主要从事未知物分析，近半年的时间接触到原研药逆向工程，这里和大家交流一下工作情况，主要还是需要向大家学习。以下就根据自己这半年的学习总结了一些些，对于逆向工程本人还是没有那么专业，如有不对的地方期望大家批评指正。 正文 什么是逆向工程？这里所讲的逆向工程主要是原研药也就是参比制剂逆向工程，是一种药品制备再现的过程，也就是对目标原研药进行逆向分析，从而得出定性配方、原料药的晶型、辅料的含量及制备工艺等要素，以制备出质量和疗效与原研药一致的产品。 逆向工程的应用有助于降低制剂开发的难度、减少处方开发的工作量、缩短研发的时间，进而提高BE的通过率。逆向工程研究并非100%和原研一致，这也是不可能做到的，而是要做到关键指标和原研一致。得出关键性指标数据，帮助药企缩短研发时间，抢占市场先机。 我司是在16年的时候大力发展医药事业。那个时候接触到一致性评价，发现很多药企需要对原研药进行剖析，以缩短制剂研发时间，抢占市场。因此，我司开始着手准备这块业务，对接并服务药企。 那么如何进行仿制药逆向研究呢？ 一、调研 工欲善其事必先利其器。欧美的药监局数据库均对中国开放，找到原研制剂的相关资料并不难。另外，很多药企客户是可以提供相关资料的。主要是重点关注原研药的处方成分、单位重量、外观、原料药晶型、包衣材料、包装材料、以及其临床和药代动力学参数。可以通过查询相关的专利、专业的数据库、药监局官网和百科等调研以上相关参数资料。 我司的重点是对原研药进行剖析，包括原研药中API和辅料的成分，尤其是辅料成分，需要针对性的查找相关辅料的性质、性能及定性定量的方法。 二、剖析 逆向工程主要的研究内容是原料药、辅料和工艺。首先原料药的晶型、粒度及杂质等都会影响其效用，因此需要前期确认原料药的这些关键性参数。我司针对这一块有分子结构确证和杂质方法开发等服务。 其次就是辅料，辅料是制剂中补课缺少的部分，具有赋型、崩解、稳定等作用。辅料的含量、型号等都需要进行确认才能够保证与原研药的一致性。解码一个参比制剂的定量成分，首先应该确定哪种辅料最影响处方的性能质量（即稳定性或溶解性）。这些数据将提供有关逆向工程所需要的资源信息。对辅料的定量是一项挑战，因为其他辅料可能会干扰。因此辅料必须首先从使用技术，如溶解性，实现片剂基质分离，常用的方法有高效液相色谱法、高效薄层层析法和分子排阻色谱法等。再一个就是制备工艺，工艺的不同也会对药效产生影响，所以需要尽可能的还原制备工艺，尤其是制粒的方式。 1、原料药的晶型 首先需要通过查询相关专利确认原研制剂中原料药的晶型及粒径等信息，其次就是通过X射线粉末衍射、红外光谱法、热分析及拉曼光谱法等分析手段，确认原料药的晶型。目前片剂中晶型检测常用X射线粉末衍射。除乳糖外，其他辅料无明显的晶型衍射。通过对比原料药、原研制剂和自制剂在相同条件下的XRD测试图，确定原料药的晶型结构。如果判断两个晶态样品的晶型物质状态是否一致时，应该满足衍射峰的数量相同、衍射峰位置误差范围在±0.2°内。如果满足以上条件，可以认为晶型一致。这个方法主要是针对拥有晶型的原料药且原料药占比比较高的制剂。 2、辅料的含量 可以查阅相关文献等资料，确定辅料组成及大致含量。片剂中常用的辅料微晶纤维素、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮等。对辅料含量进行测定在仿制药研发中尤为重要。常用的辅料含量剖析方法有元素分析法、色谱光谱法、洗涤分离法等。其中元素分析法主要测试手段有ICP-OES和ICP-MS等，针对硬脂酸镁、二氧化硅等还有特征元素的辅料的测定。色谱、光谱法包括HPLC、GC-MS、LC-MS和UV等手段，乳糖的含量可以通过HPLC-ELSD法进行测定。硬脂酸可以通过GC-MS进行测定。十二烷基硫酸钠可以通过LC-MS进行测定。洗涤分离法主要是针对样品中不溶辅料，如淀粉、微晶纤维素等。片剂中常用的辅料除微晶纤维素和硬脂酸镁不溶外，其他几乎全溶，因此可以通过对片剂进行溶剂洗涤分析，称取不容物的含量，得出微晶纤维素的含量。 3、工艺 由于我司没有制药经验，这一块研究的比较少。关于工艺方面，目前只是通过扫描电镜方法观察制剂的微观形貌，试图从中找出相关规律。这里比较好确认的是微丸造粒，在扫描电镜下可以很清楚的看到微丸颗粒。 三、案例分析 1、液体制剂 以盐酸莫西沙星滴眼液为例，原研说明书上公布其辅料有硼酸、氯化钠和注射用水，可能还有盐酸或者氢氧化钠调节pH用。结合原研说明书上的信息，对制剂进行相关的测试分析，由此就可以确认处方，避免了处方筛选的过程。具体如下：
通过对液体制剂进行烘干处理，进行FTIR、MS和NMR测试，可以确定制剂中添加的是盐酸莫西沙星，为原料药。另外，可以通过核磁内标法和高效液相色谱法对原料药进行定量分析，由于核磁内标法收到积分面积的影响很大，因此定量上存在一定误差。这里更推荐使用高效液相色谱法对原料药进行定量分析，可以进行方法学验证，保证方法和结果的稳定和准确性。通过原研说明说我们知道样品中含有硼酸，这里可以通过ICP-OES对硼元素进行定量分析，由硼元素的含量计算出硼酸的含量。氯化钠可能为盐酸和氢氧化钠反应产物，可以通过ICP-OES对钠元素进行测定，通过IC对氯离子进行测定，另外结合样品本身的pH值计算出氯化钠的含量。样品中的水分可以通过卡尔费休法进行水分含量测定。 2、片剂辅料 以HJ08原研制剂为例，客户主要关注制剂中的乳糖、十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁和交联羧甲基纤维素钠的含量。针对客户提出的物质，通过查询相关的文献资料，确认各物质定量的方法，具体如下：
客户已经告知原研药中辅料信息，需要对辅料含量进行精确测试。通过查询相关资料，辅料中乳糖的含量可以通过HPLC-ELSD进行准确定量分析。十二烷基硫酸钠为阴离子表面活性剂，且溶于水，因此可以通过LC-MS对十二烷基硫酸钠进行含量测定。硬脂酸镁可以通过ICP-OES进行镁元素含量测定，从而计算硬脂酸镁的含量。这里需要注意的是，硬脂酸镁不溶于水、不溶于酸碱等溶液，因此在进行湿法酸消解时，有可能会消解不完全，导致结果存在偏差。在不断的尝试后，发现可以进行干法消解，也就是先对制剂进行烧灰分处理，然后在测试镁元素含量，这个前处理方法大大提高了硬脂酸镁含量测定的准确度。交联羧甲基纤维素钠可以通过将其他辅料全部准确定量后进行差减而得出含量。另外，交联羧甲基纤维素钠一个重要指标就是取代度。如果查询到其取代度，并查询基本结构单元，可以通过钠元素的含量计算出交联羧甲基纤维素钠的含量。由于交联羧甲基纤维钠较为复杂，其含量测定方法还在研究。 3、辅料牌号确认 以聚维酮为例，不同型号的聚维酮分子量不同，因此可以通过测试聚维酮的分子量分布，确认聚维酮的具体型号，具体如下：
从上表可以看出，样品中的聚维酮的分子量和聚维酮K17接近，因此基本可以判定样品中使用的是聚维酮K17。 另外，我司还做过一些定性研究，比如淀粉、植物油和纤维素等牌号的确定研究。以羟丙基甲基纤维素为例，对不同牌号的羟丙甲基纤维素进行衍生化，在进行GC-MS测试，通过对测试数据的计算，可求的实测到羟丙甲基纤维素中甲氧基和羟丙基的含量，通过数据的换算可对羟丙基甲基纤维素的牌号进行判断。但是如果体系中有淀粉或者其他纤维素会影响牌号的确认。 |
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