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1.1 IVD产品生产技术的发展路径 图1 体外诊断产品的发展路径
整体而言，体外诊断技术的发展经历了三个时期。上世界中叶之前，一直处于实验生物学时期，体外诊断的技术非常传统，检验范围有限；50年代以后，免疫诊断开始发展，分子诊断技术出现；2000年以后，免疫诊断技术不断成熟完善，分子生物学技术广泛应用到体外诊断领域中。 1.生化诊断 生化诊断产品不论在国内亦或海外都已熟透，技术壁垒低，面临被其他更精确快速的诊断技术完全替代的风险，国内寡头中生北控（8247.HK）、科华生物、利德曼等对市场的垄断力非常强劲。 2.免疫诊断 免疫诊断在海外发展了60多年，技术较成熟。与生化诊断不同，免疫技术和后来兴起的分子技术体外核酸扩增技术（PCR）目前对同类疾病诊断的特异度和灵敏度几乎平分秋色，所以近期被替代的风险小，主要是内部的技术升级换代——国外是寡头边垄断着市场边自我升级；国内则处于大洗牌期，跟不上国外寡头升级节奏的就只能抱憾出局。 免疫诊断领域技术的发展经历了多个阶段。目前同位素放射免疫由于环境污染问题已基本被淘汰。根据2015年的市场数据分析，我国免疫诊断市场中，酶联免疫占据约60%的市场份额，化学发光占据约40%的市场份额；而国外市场中，发光诊断的市场份额高达90%，占据免疫诊断的主要市场份额。而化学发光集多项优点于一身，成为免疫诊断的主流方向，是IVD行业中的黄金细分领域。 图2 免疫诊断技术的升级换代
摘自东兴证券研究报告 3.分子诊断 目前在耐药性治疗和研究中，主要采用细菌培养方法及分子诊断方法做药敏实验。细菌培养方法耗时长，实验结果需要2-5天甚至更长时间才能得出。分子诊断直接针对微生物DNA变化而做出检测，实验结果只需几个小时，能快速发现微生物是否具有耐药性。尽管肿瘤耐药性的发生机制十分复杂，至今还未了解其本质，但是医学界比较公认是，化疗失败主要与癌细胞对化疗药物具有或产生了耐药性有关，现已发现多种与肿瘤多药耐药相关的分子或基因。因此，在肿瘤耐药性的研究中，分子诊断具有不可替代的作用。 分子诊断是当代医学发展的重要前沿领域之一，相比免疫诊断，优势在于诊断结果更加精准，并且可以诊断遗传性疾病。分子诊断的常规技术包括：（1）聚合酶链式反应（PCR）；（2）DNA测序（DNAsequencing）；（3）荧光原位杂交技术（FISH）；（4）DNA印迹技术（DNAblotting ）；（5）单核苷酸多态性（SNP）；（6）连接酶链反应（LCR）；（7）基因芯片技术（genechip）。其中，PCR产品占据目前分子诊断的主要市场，基因芯片是分子诊断市场发展的主要趋势。 PCR产品灵敏度高、特异性强、诊断窗口期短，可进行定性、定量检测，广泛用于肝炎、性病、肺感染性疾病、优生优育、遗传病基因、肿瘤等，填补了早期免疫检测窗口期的检测空白，为早期诊断、早期治疗、安全用血提供了有效的帮助。主流的PCR技术据说比当下主流免疫技术的壁垒低，国内市场处在“伪寡头真红海”的局面。 基因芯片是分子生物学、微电子、计算机等多学科结合的结晶，综合了多种现代高精尖技术，被专家誉为诊断行业的终极产品。但其成本高、开发难度大，目前产品种类很少，只用于科研和药物筛选等用途。 历经20余年发展，我国分子诊断历程主要分三个阶段：
1.2 主要的免疫诊断技术简介 1.免疫诊断的几类技术 （1）胶体金法 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。 用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 胶体金法是非常成熟的技术，广泛用于肝炎、艾滋病、早孕等检验试剂产品。 图3 胶体金法试剂的应用示例
（2）酶联免疫（ELISA） 酶联免疫（ELISA）是让抗体与酶复合物结合，既保留抗体免疫活性，又保留酶的活性，然后通过显色来检测。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 图4 酶联免疫的原理图
ELISA也是非常成熟的技术，已被广泛应用于多种细菌和病毒等疾病的诊断。在动物和食品检疫方面，ELISA在猪传染性胃肠炎、牛副结核病、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病等的诊断中已为广泛采用的标准方法。 （3）化学发光法 化学发光免疫法（ChemiLuminescence，简称为CL）是分子发光光谱分析法中的一类。化学发光是伴随化学反应过程所产生的光的发射现象，当某些物质在化学反应时吸收了反应过程中的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到稳定的基态时，多余的能量以发射光子的形式释放出出来，这一现象称为化学发光。 化学发光免疫将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。该技术通常由参与催化某种化学发光反应的酶（如HRP或ALP）来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体‐待测抗原‐酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入相应底物(发光剂)，由酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算测定物浓度。 图5 化学发光免疫的原理图
综上而言，不同的免疫学诊断方法，有其不同的特点和应用场景，比较如下： 图6 不同免疫诊断方法比较
2.分子诊断的几类技术 （1）聚合酶链式反应（PCR）技术 聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 （2）基因芯片技术 简单的讲，基因芯片就是按照预定位置固定在固相载体上很小面积内千万个核酸分子所组成的微点阵阵列，在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核算片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。 图7 基因芯片技术图解
基因芯片技术国外市场美国illumina公司一家独大。在SNP芯片研究领域，美国illumina公司毫无疑问是霸主，illumina公司凭借自己开发的GoldenGate技术和infinium专利技术一直在SNP芯片领域处于垄断地位。illumina的全基因组表达谱芯片是目前唯一一种可以达到探针30倍重复的表达谱芯片，其他的芯片都只能达到1-8倍技术重复。因此illumina的全基因组表达谱芯片的重复性是所有芯片中最高的，其重复性R2＞0.996，并且基于第三代基因芯片独特的微珠芯片生产工艺，芯片生产成本较低，信噪比和灵敏度都非常高，其灵敏度≤1:250,000，芯片检测结果和qPCR相关系数R2=0.97。因为illumina所占的市场份额越来越多，2012年6月另一基因芯片大厂家Nimblegen公司，正式宣布退出基因芯片市场。 国内基因芯片制造水平低，相关的企业规模小、投入也少，远达不到国外的水平。所以国内的相关公司均以引进国外基因芯片，提供检测服务为主。不过，随着基因芯片的应用推广，一些公司也开始涉足基因芯片制造。上市公司达安基因，业务以体外诊断为主，产品主要是试剂盒，但也开始涉足基因芯片制造。而另一以基因检测服务著称的大企业华大基因，则通过收购国外公司进入基因芯片制造领域。美国上市公司CompleteGenomics公司有自己基因芯片和芯片检测设备。但该公司2011年的业绩只有2000多万美元，其基因测序服务成长大大低于预期，股票跌破发行价，最后被中国华大基因收购。联川生物在microRNA芯片领域也小有名气，也是唯一一家国产的microRNA芯片，该芯片最大的特点就是更新速度极快，一般新的数据库发表后，第一个将芯片更新到最新版本的就是联川生物。illumina公司于2010年退出了microRNA芯片市场，因illumina公司2006年收购了高通量测序领域NO.1的Solexa公司，成为唯一一家即拥有芯片平台又拥有高通量测序平台的供应商，illumina认为在microRNA领域，高通量测序有不可比拟的技术优势，必然会取代芯片，所以于2010年停产了microRNA芯片。 生物芯片技术正逐渐成为分子诊断的主流技术和未来发展方向，在我国尚处于发展初期，国内生物芯片技术与国外有一定差距，国内仅有少数几家企业具备进入该领域的实力。 本期参考文献： 1.透景生命、凯普生物、安图生物、基蛋生物招股说明书； 2.《价值再发现,不一样的 IVD——体外诊断行业深度报告》，兴业证券研究所。 |
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