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我是郭大侠，这两天一直在复旦江湾城校区蹭表观遗传课，没想到骨头这个小胖子也在。几天没见骨头，这丫头又胖了一圈，一问才知道是被课题愁的：骨头的师姐毕业走人后留下了一个做了半拉的lncRNA，老板让骨头找到与这个lncRNA结合的miRNA，然后把机制完善。可是骨头完全不知道怎么入手，这种时刻本大侠当然要出来扶危济困。首先就来策一下做miRNA-lncRNA interaction的工具。
工具叫做starbase（http://starbase./），这个数据库是基于108个CLIP-Seq(HITS-CLIP, PAR-CLIP, iCLIP, CLASH)数据集分析挖掘miRNA-lncRNA,miRNA-mRNA, miRNA-circRNA等一系列作用关系的数据库，由中山大学维护。本数据库功能众多，今天只介绍如何预测与lncRNA结合的miRNA。进入页面后，选中miRNA-lncRNA下拉菜单中的miRNA-lncRNA interaction选项（图1），进入如图2所示界面，在1.中选择好物种，5中录入想要研究的lncRNA名称，这里我们就录入“HOTAIR”，点击Search按钮，得到如图3所示结果，点击TargetSite中的数字就可以看到具体的结合部位。
图1.如何进入miRNA-lncRNA interaction。 
图2. miRNA-lncRNA interaction输入界面。 
图3.与HOTAIR相互作用的miRNA
在这里需强调的是，starbase中所有的数据都来自于肿瘤组织的CLIP-Seq，也就意味着预测数据并不全面；此外如此简单的工具当然不是我们今天要策的重点，像这样的工具在Nucleic Acids Research Database Summary（http://www./our_journals/nar/database/c/）中有很多，比如RegRNA2.0：http://regrna2.mbc./detection.html；再比如RNAhybrid：http://bibiserv.techfak./rnahybrid；再比如miRanda：http://www./microrna/getMirnaForm.do。大家可以多预测几个数据集，然后做Venn图找到支持自己实验的数据。Venn图怎么做看右叔的帖子。
策了一堆，现在回到我们的主题：为啥你辛辛苦苦做的lncRNA会被reviewer毙掉。这牵涉到研究lncRNA的两个经典思路，Sponge途径（即lncRNA吸附miRNA从而实现对其他mRNA的调控）和蛋白结合途径。Sponge是现在国内做的非常火热的一种lncRNA思路，特别是2011年ceRNA理论被提出后，大量的做miRNA的科研人员follow这一思路刷了一大波文章。这种思路有其自己的优势，即通过简单的生物信息学预测结合双荧光报告即可阐明lncRNA机制，实验技术相对简单。但是从2014年后，这种思路的文章已经很难发到高分杂志，而且大批通过这种思路撰写的标书也被毙掉。这是为什么呢？
郭大侠本人在lncrna研究领域中属于小虾米，但是在担任着3个2分左右杂志的审稿人，每年也会拿到30+的标书评阅，就从自己的角度谈一谈，为何大家辛辛苦苦做的miRNA-lncRNA interaction被毙掉。起因从2014年的一篇生物物理学文章谈起，这篇paper证明了一个事实，一个简单的点对点ceRNA调控轴想发挥作用，对应的miRNA和lncRNA必须达到一定丰度。也就是说，lncRNA必须分布于细胞质中，同时高丰度表达；miRNA必须在研究细胞中表达较高。具体到实验线索中，实验者必须通过Northern blot，证明miRNA和lncRNA在实验细胞中高表达，同时必须通过FISH（原位杂交），证明lncRNA在包浆中有较高比例分布。离开这两个实验去谈sponge，稍微懂行的reviewer都立刻会对你的data提出大量质疑；如果reviewer不幸看过特定细胞的miRNA-Seq数据，你提出的miRNA丰度又比较低，整个实验数据被毙掉是板上钉钉的！
那么lncRNA的机制又该怎么策呢？郭大侠自己总结，认为lncRNA具有四大生物学功能：1、Sponge作用，这里就不详谈了。2、蛋白活性调节分子，如第二军医大学曹雪涛院士发现的lnc-DC可以影响STAT3活性调节树突状细胞发育。3、基因组DNA与结合蛋白的楔子，有些lncRNA（多为lincRNA）一端可以结合DNA的某一区域，另一端形成复杂的三级结构，引导相关蛋白与DNA作用。4、调节染色质状态，lncRNA可以与表观修饰酶相互作用，诱导表观修饰的改变。研究发现，80%以上的lncRNA都分布于核中，因此3和4才是lncRNA的主要作用方式。这就提示着我们想做lncRNA的机制，必须去做RNA pull down实验，之后MS（质谱）或者WB（Western blot）鉴定拉下来的蛋白。
从今年lncRNA领域所发表的文章看，sponge套路已经很难说服专业的reviewer，尽管RNA pull down实验有一定难度，而且kit很贵，但是在这种潮流下lncRNA的实验者必须学会这一实验。当然能不能躲开花费昂贵的MS，而直接WB验证pull-down蛋白，郭大侠还是有一点小技巧。这就是使用RBPDB数据库（http://rbpdb.ccbr./）直接预测lncRNA的作用蛋白。如图5所示，只要把lncRNA的序列pia进其中的文本输入框中，点击提交，即可获取潜在的结合蛋白（图6，以HOTAIR为例），之后pull-down结合Western验证即可，对付5分左右的文章是足够了。
最后还想强调一下Nucleic Acids Research Database Summary的重要性，建议每个人拿出2天时间，看看里面的东西，都是科研捷径。 
图4. RBPDB数据库主界面
图5. HOTAIR的潜在结合蛋白
…华丽丽的分割线…
李莫愁博士：不光是lncRNA，其实作为Sponge的还有cricRNA，不过我想一般的mRNA说不定也能做Sponge……Whatever，随便啦，好了今天就策到这里吧。还是请大家无私地给郭大侠打赏哦！
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