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3月15、16日，Cell子刊Molecular Cell杂志在线发表了两篇重要的环状RNA研究论文，其中一篇文章的通讯作者为意大利罗马萨皮安扎大学Irene Bozzoni教授，介绍发现了环状RNA Circ-ZNF609可直接翻译蛋白，该蛋白参与肌肉发生过程[1]。
另一篇文章的通讯作者是以色列希伯来大学的Sebastian Kadener教授，介绍基于果蝇大脑中核糖体印迹分析（ribosome footprinting）发现大量的环状RNA翻译蛋白或多肽的情况[2]。
两篇文章作者都包括大名鼎鼎的环状RNA研究专家Nikolaus Rajewsky教授。下面就让我们一起欣赏一下这两篇文章吧。首先来详细了解下第一篇文章：
Circ-ZNF609可直接翻译蛋白并参与肌肉发生过程 文中作者首先筛选与肌肉发生有关的环状RNA，人和小鼠中都进行了筛选，还选择了杜氏肌营养不良疾病模型一并进行筛选。最终筛选到一批特征性的环状RNA，接着，作者又针对这些环状RNA进行了RNAi文库筛选，以找出对肌肉发生功能有关的环状RNA。基于这一系列的筛选，作者最终发现了Circ-ZNF609。接下来针对Circ-ZNF609的功能研究作者验证了其翻译多肽的功能，并针对该功能进行了一系列的生化验证实验。
图1 Circ-ZNF609可直接翻译蛋白并参与肌肉发生过程（来自[1]）
肌肉发生相关的环状RNA鉴定：
作者研究的出发点是分析肌肉发生有关的环状RNA。为找到有功能的环状RNA，作者在实验设计上便有充分的考虑，选用了人和小鼠的体外分化模型，还选择了杜氏肌营养不良患者模型作为进一步功能验证的参考。所进行的环状RNA分析鉴定的常规工作与其他文献并无二致。最终找到了574个人鼠同源的环状RNA，91个为高表达状态。
图2哺乳动物成肌细胞分化中鉴定CircRNA （来自[1]）
接下来，作者比较了成肌细胞和肌管中环状RNA的表达差异情况，同时比较了杜氏肌营养不良症的患者，结果表明在成肌分化过程以及疾病中环状RNA的表达状态有所改变。
图3 成肌分化过程以及疾病中环状RNA的表达状态有所改变 （来自[1]）
接下来，作者采用了RNAi的方法针对所筛选到的环状RNA进行功能分析，采用高内涵筛选的体系进行。作者设置的候选环状RNA条件包括：(1) 保守性高；(2) 表达水平高；(3) 分化过程中有差异；(4) 环状/线性的比例。基于这四种筛选条件，作者找出了31中候选的环状RNA。作者进行了QPCR验证和RT-PCR后电泳检测，与大多数同行遇到的情况类似，他们的绝大部分电泳结果也出现了一条或多条大分子量的条带，作者的解释是滚环反转录的产物，这也得到了胶回收测序的验证。
所筛选的31条环状RNA除了circ-MYL4没有鉴定出来，Circ-TTTY16没有在小鼠中鉴定到（该基因位于Y染色体，作者选的小鼠细胞为雌性来源），剩下的29种环状RNA按照以下标准设计干扰RNA：(1) 结合位点跨过环化位点；(2) 7-mer的种子序列不在线性RNA中存在；(3) 种子序列进行化学修饰，以减少miRNA样效应和passenger strand失活直接导致链特异性Ago蛋白募集。基于这三条标准，有20个环状RNA能设计出两条干扰RNA，有5个能设计一条，还有4个没法设计出干扰RNA。作者就先用这45条干扰RNA进行了高内涵筛选。
作者从分化的标志物鉴定的结果找到了两个变化比较明显的。一个是QKI基因和对应的环状RNA，另一个是BNC2基因。由于所设计的干扰RNA会存在不同程度的对线性RNA的影响，在序列允许的情况下，作者也增加了针对线性和环状RNA的干扰RNA，并验证了对分化过程的影响。QKI基因方面，干扰circ-QKI和线性QKI都会影响成肌分化。BNC2基因方面，干扰线性BNC2可影响分化，干扰circ-BNC2不明显。作者又针对细胞增殖能力设计了BrdU掺入实验进行高内涵筛选，这个实验中作者发现 干扰circ-ZNF609后BrdU的掺入效率降低了80%！在正常分化的组中circ-ZNF609明显下调，然而在杜氏肌营养不良组circ-ZNF609是升高的。
图4 RNA干扰实验 （来自[1]）
circ-ZNF609可翻译蛋白 circ-ZNF609由ZNF609基因的第二外显子独自环化形成，这其中包含了ZNF609基因的起始密码子，分析circ-ZNF609的阅读框就会发现在ZNF609基因的起始密码子所在的阅读框的终止密码子恰好位于环化位点之后，也就是circ-ZNF609形成环状RNA后环化位点后引入了终止密码子。
为验证circ-ZNF609是否能翻译蛋白，作者首先基于蔗糖密度梯度离心法分析了circ-ZNF609结合核糖体的情况，结果表明部分circ-ZNF609上面确实有多聚核糖体结合。为排除线性RNA的干扰，作者也通过Northern实验和非环化区域引物RT-PCR实验进行了验证。
图5 circ-ZNF609可翻译蛋白（来自[1]）
作者通过构建过表达circ-ZNF609的载体，同时构建了各种突变体，反复证实了circ-ZNF609可表达蛋白。有趣的是，在circ-ZNF609的阅读框中，同一个阅读框的两个其实密码子都具有起始蛋白翻译的作用，分别突变掉以后就不能翻译出相应的蛋白。为验证内源性circ-ZNF609的蛋白翻译功能，作者还构建了基因组转基因模型，在野生型ZNF609的基因前端增加了3×Flag标签。基于蛋白组学分析和Western验证，证明了内源性circ-ZNF609的蛋白翻译功能。但环状RNA circ-ZNF609的蛋白翻译的效率几乎比线性的RNA低了两个数量级。进一步的分析表明，circ-ZNF609的蛋白翻译活动是IRES驱动的。
图6 circ-ZNF609可翻译蛋白（来自[1]）
为节省篇幅，暂不对这篇文章的具体内容进行详述了，感兴趣的读者可以找到这篇文章仔细阅读。本文是今年的有一篇关于环状RNA可翻译蛋白的重磅级研究成果。从本文中，我们可以总结出关于环状RNA可编码蛋白这个想法的实验需要考虑以下几个方面：(1) 预测阅读框，看阅读框与环化位点的关系，阅读框上游是否有调控性元件（IRES，m6A修饰保守位点等）。(2) 过表达和突变实验：充分论证各个调控序列和位点的功能。(3) 通过转基因技术增加标签或直接制备特异性抗体验证内源性环状RNA的翻译功能。(4) 分析目标环状RNA募集和结合核糖体的能力：蔗糖密度梯度离心，嘌呤霉素处理等。这四个方面都是非常有价值的，对于论证目标环状RNA翻译蛋白或多肽都是非常重要的实验。
环状RNA翻译蛋白 第二篇文章则主要讲述了探讨环状RNA直接翻译多肽的问题。下面我们转入这篇文章：
在这篇文章中，作者在果蝇的大脑组织中进行核糖体印迹分析，发现了有些环状RNA可以结合到核糖体上，于是作者认为环状RNA有可能具有翻译蛋白的功能。经过一系列的严谨实验论证，作者得出结论：部分环状RNA可翻译蛋白。核糖体印迹分析中证明circMbl中的终止密码子处有核糖体结合。circMbl所编码的蛋白在蛋白质谱中得到证据。
首先作者从核糖体印迹分析的测序数据中找出了一些环状RNA的结果：
图7 果蝇核糖体印迹分析中发现环状RNA （来自[2]）
作者选择了Mbl基因作为研究对象。利用构建的过表达载体，作者构建了带V5标签的过表达环状RNA载体，然后验证这些环状RNA的翻译蛋白特性，还构建了将预测的ORF替换为Cherry荧光蛋白的载体进行验证。
图8 构建的环状RNA过表达载体验证环状RNA表达蛋白（来自[2]）
作者利用核糖体印迹实验选择果蝇头部进行分析，找出了若干可结合核糖体的环状RNA。作者选择了两种样品制备条件，一种是不含去污剂的，另一种是与常规方法一样浓度去污剂的。为排除非特异性的分析结果，作者构建了一个算法，用于排除非标准阅读框的起始或终止密码子的干扰。结果表明绝大部分核糖体印迹测序的Reads均位于标准阅读框区间，少数位于UTR区。接着，作者分析了环状RNA的情况，从数据的特征排除了随机性结合的可能性。作者共在所分析的样品中找出了122条能结合核糖体的环状RNA，其中circSh的比例最高。
图9 果蝇全基因组水平核糖体印迹实验筛选具有翻译蛋白作用的环状 RNA（来自[2]）
有一种可能是普通的线性RNA携带了可变剪切的RNA，导致最终作为环状RNA的结果，这就可能造成假阳性的问题。作者设计了基于带EGFP标记转基因的核糖体的果蝇转基因细胞进行验证实验。利用EGFP进行IP实验，然后分析所结合的RNA。以此证明核糖体确实可以结合在环状RNA上，而不是简单的因为结合了可变剪切产物而带入了假阳性的结果。RNase R的实验也证明了这一点。
作者挑选了Mbl基因进行进一步的研究分析，作者首先分析了Mbl基因对应的环状RNA可能翻译的蛋白序列，然后体外合成了相应的肽段，做出了质谱的标准图谱，然后在细胞的产物的质谱数据中找出符合标准图谱的结果。最终在该基因的一个环状RNA产物circMbl3（由该基因的外显子2-6环化形成）对应的肽段找到了直接的质谱证据。这个肽段的序列与目前已报道的Mbl基因的各种Isoform编码的多肽序列均不相同，排除了已知多肽编码序列的干扰问题，肯定是由circMbl3所对应的阅读框而来的。
图10 部分环状RNA能结合到正在翻译的核糖体上（来自[2]）
具备编码多肽能力的环状RNA会有什么特征呢？
这是一个非常有趣的问题，作者也针对该问题设计了实验。作者首先分析了151个核糖体结合的环状RNA的5’UTR区，总结出一点规律，作者发现约40%的可翻译环状RNA与所对应的线性RNA共用相同的起始密码子，可翻译环状RNA相对于其他环状RNA的分子更长，以此提供满足蛋白翻译调控序列的空间，约72%的可翻译环状RNA具有预测阅读框上游序列。可翻译的环状RNA相对进化更保守。
图11 可结合核糖体的环状RNA 基本特征（来自[2]）
由于环状RNA不带5’帽子结构，因此环状RNA的翻译过程很可能是5’帽子不依赖的翻译途径。5’帽子依赖的翻译途径可被过表达的4E-BP蛋白抑制，因此作者在果蝇细胞中过表达4E-BP蛋白看蛋白翻译的影响情况。结果表明过表达4E-BP蛋白显著抑制线性RNA编码的GFP报告基因，但环状RNA载体编码的则变化不明显。这表明环状RNA载体表达的蛋白翻译过程不受过表达4E-BP蛋白的抑制。作者又分别构建了circMbl、circCdi、circPde8和circTai的UTR序列的荧光素梅报告基因系统，结果也表明这些环状RNA的UTR区均能在环状RNA的形式下表达出荧光素酶基因。作者也进一步分析了circMbl所编码蛋白的基本功能。
图12 可翻译蛋白的环状RNA中IRES序列分析（来自[2]） 这两篇文章都是非常重要的环状RNA研究论文，进一步证实了环状RNA编码多肽和蛋白的功能。这无疑为环状RNA的功能研究找到了一个出口。以后各位同仁在开展特定环状RNA的功能研究时，不仅要分析miRNA Sponge功能，更需要大胆预测和验证它们是否具有直接翻译多肽和蛋白的功能。这为环状RNA 的功能研究提供了非常有价值的思路。
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