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外泌体（exosomes）是活细胞分泌的直径约为30-150nm的膜性囊泡，准确来讲，外泌体是一类由细胞释放的细胞外囊泡。根据其生物合成或释放途径可以对细胞外囊泡进行分类： 1.外泌体(exosomes)：起源于内吞途径，直径为30-150nm，其密度约为1.11-1.19g mL-1； 2.微粒/微囊泡（microparticles）:直接从质膜释放，直径约100-1000nm； 3.凋亡小体（apoptoticbody/bleb）:由细胞凋亡产生，直径约为50nm-2um； 4.肿瘤小泡（large oncosomes）:由肿瘤细胞释放产生，直径约1-10um; 5.以及其他各种EV亚群; 外泌体广泛存在于多种体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。起初人们认为它是一种细胞的废弃物，并未受到足够的重视。2013年的诺贝尔生理或医学奖颁给了三位科学家，他们分别是美国科学家James E．Rothman、Randy W．Schekman以及德国科学家Thomas C．Südhof，以表彰他们发现细胞内部囊泡（外泌体等）运输调控机制,使外泌体的研究达到全新的高度。 研究发现外泌体能够运载其内源性的蛋白质、脂质、各种代谢酶、mRNA和其他非编码RNA如Mircrorna等，参与重要的细胞间通信过程，尤其在免疫应答/肿瘤侵袭过程中参与重要作用；同时，外泌体的类型和水平，以及携带的蛋白、脂类、mRNA、miRNA、DNA 可以作为生物标志物，作为疾病诊断的依据；外泌体具有脂质双层膜结构，对内容物具有很好的保护作用，可以用作药物载体靶向特定细胞或组织。 如前所述，外泌体存在于多种体液，因此细胞培养的胎牛血清中往往含有外泌体，对于实验研究造成影响。 为了避免外来外泌体体的污染，细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间，贴壁细胞密度在60%-70%，去除原有培养基，换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基并继续培养24-48小时。根据细胞的生长速度确定收取上清时间，收集细胞培养基后即可进行外泌体的提取了。 目前常用的外泌体的提取方法主要包括：(1)差速离心法（2）超滤法（3）试剂法 差速离心是外泌体分离的最常见技术之一，常用于细胞培养上清中外泌体。步骤如下所述。注意：所有离心分离应在4℃下进行。同时吸取上清时小心操作，避免吸入细胞或者细胞碎片。 （1）低速离心以除去细胞成分，300g离心10min。收集上清。 （2）低速离心去除死细胞，2000 g离心10min。收集上清。 （3）高速离心以消除细胞碎片，10000 g离心70min。收集上清。 （4）高速离心以沉淀外泌体。100000 g离心70min。收集沉淀。 （5）外泌体重悬于适量PBS中，消除污染蛋白质，100000 g离心70min。收集沉淀。 （6）分装外泌体悬液，-80度保存，避免反复冻融。 超滤法适用于细胞上清的提取，一般需要200ml培养基，适用于纯化大量外泌体。最常见的过滤膜有孔径0.8微米，0.45微米或0.22微米，可用于收集大于800纳米，400纳米或200纳米的外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性。 （1）低速离心以除去细胞成分，500g离心10min。收集上清。 （2）使用0.22微米过滤器过滤细胞碎片以及大囊泡。收集滤液。 （3）将滤液转移至装有超滤膜的超滤仪，氮气加压过滤。收集滤液。 （4）将过滤后悬液转移至离心管，100000 g离心40min。收集沉淀。 （5）外泌体重悬于适量培养基中。使用0.22微米过滤器过滤,分装外泌体悬液，-80度保存，避免反复冻融。 试剂盒法适用于细胞上清，一般需要50-100ml培养基。该试剂盒使用容易和快速，耗时短。 （1）低速离心以除去细胞成分，3000g离心10min。收集上清。 （2）将滤液转移至离心管，加入试剂。 （3）上下颠倒混匀。 （4）1500g离心30min，管底可见沉淀，小心弃去上清。 （5）1500g离心10min，小心弃去上清。 （6）外泌体重悬于适量培养基中。使用0.22微米过滤器过滤,分装外泌体悬液，-80度保存，避免反复冻融。 除此之外，外泌体分离还有其他方法，如密度梯度离心、聚合物沉淀法、免疫分离法等，可以根据实验目的结合实验条件进行选择。当然，分泌外泌体最关心的是外泌体的纯度以及准确性，因此需要进行对外泌体进行鉴定。下期继续为大家介绍外泌体的鉴定方法。 |
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