|
荧光染料是细胞生物学等科学研究中不可或缺的重要工具，荧光滤色块是荧光显微镜中至关重要的一个部件，只有对两者进行合理的选择和搭配才能拍出理想的荧光图片。在实验室中，荧光染料染色效果不好，荧光滤色块观察效果不佳的情况时有耳闻，如何从琳琅满目的荧光染料和滤色块中挑出适合自己使用的呢？本文首先简单介绍下荧光的相关基础知识，然后通过实例来详细讲解在选择与搭配两者时应该遵从的原则以及需要注意的事项。 首先讲讲我自己的学习历程吧。我是从研究生阶段才开始接触荧光显微镜的，以前在本科的时候也就是用透射光看看各种细菌真菌，然后画个图交上去就完事了。荧光的成像原理要比透射光复杂得多，所以一开始接触荧光这些东西确实挺头大的。由于是老板招的第一届研究生，研究方向是植物细胞生物学，没有师兄师姐带，老板也没时间给我指导这些基础知识，什么都得靠自己学，我的学习之路就是从老板给我的一张Molecular Probes（MP）光盘开始的（图1）。这是一张MP公司的荧光染料操作指南，是老板从美国带回来的，版本是2001年的第八版，里面介绍了各种染料的分子结构，物化属性，染色原理，染液配制，染色步骤，参考文献等等，把各种染料的方方面面都介绍得非常详细。众所周知，MP（2003年被Invitrogen收购）是全球最专业的荧光染料生产商，产品种类齐全，各种新型的荧光染料也层出不穷。我最初的荧光知识就是从这张光盘中学来的，平时在配制和使用染料之前也会仔细阅读里面的操作指南（现在的最新版本是2010年9月份推出的第十一版，大家可以通过Invitrogen网站对相关内容进行浏览）。后来，随着接触荧光显微镜的时间和相关文献阅读的积累，逐渐对这些东西有了更全面更清晰的认识。  图1. Molecular Probes公司2001年第八版的荧光探针操作手册 一、荧光基础知识的学习 这里给初学者推荐一个学习荧光基础知识的好去处：Invitrogen荧光使用指南http://zh./site/cn/zh/home/support/Tutorials.html。网站分Introduction，Spectra和Light Filter and Sources三部分对荧光基础知识进行了详细介绍，教程采用的是Flash格式，图文音并茂，虽然讲解用的是英文，不过配上动画还是很好理解的，如果听不明白的话，可以点击右下角的“NOTES”查看字幕（图2）。相比于传统教材和文献中的文字图片介绍，MP做的Flash教程更适合初学者，直观，易懂。掌握好这三个教程，就算是入门了吧。  图2. Invitrogen相关教程中的荧光产生的原理图 二、荧光染料的选择与配制 细胞生物学发展到今天，单一荧光染色早已不能满足很多科研实验的需求了，在很多实验中经常需要同时进行双色，三色和多色荧光标记。MP公司的荧光染料已经覆盖了细胞内的各个细胞器和结构，而且每种细胞器或结构都有多种不同颜色的荧光染料以供选择和搭配（图3）。通过图中各种染料，细胞的每个角落都被点亮了，一个普通的细胞瞬间变成了一个色彩斑斓的世界，太神奇了！  图3. 被点亮的细胞：用于标记不同细胞器和亚细胞结构的荧光探针 当使用多种荧光染料对各种细胞器和结构进行同时标记时，它们的选择搭配是有讲究的。这里给大家介绍一个很好玩的小工具：Cell Staining Simulation Tool（细胞染色仿真工具）。这是Invitrogen公司最近推出的一个实用小工具，链接http://zh./site/cn/zh/home/support/Research-Tools/Cell-Staining-Tool.html。从工具界面的左下角点击需要进行标记的细胞结构，然后选择想染的颜色，再从后面的产品栏中选择一个适合自己样品的染料（有些是染活细胞的，有些是染固定细胞的），选中的染料会出现在右上角，接着进行第二、三、四种细胞结构的标记，注意不同结构尽量选择不同颜色带中的染料进行标记，最后左上角会出现一个仿真的染色效果图。有了这个小工具，自己俨然成了个专画细胞肖像的大画家，赶紧先过把手瘾！我分两次用8种染料给这位细胞画了两幅肖像，第一幅是用DAPI，MitoTracker Red CMRos，Alexa 488 phalloidin与CellMask Deep Red plasma membranes stain分别标记了细胞核，线粒体，微丝和细胞膜（图4）；第二幅是用LC3B antibody with Alexa Fluor 350，ER-Tracker Red，tubulin antibody with Alexa Fluor 647与NBD C6-ceramide分别标记了自噬小体，内质网，微管和高尔基体（图5）。这个小工具非常适合对荧光染料的激发光发射光参数不熟悉或不敏感的人，可以通过颜色带来直接挑选和搭配自己想要的染料，十分直观。  图4. 细胞核，线粒体，微丝和细胞膜染色仿真效果图  图5. 自噬小体，内质网，微管和高尔基体染色仿真效果图 （一）、荧光染料选购原则 现在针对某一种物质或结构，各个厂商都会有多种荧光染料供大家选择，选购时需要注意以下事项： 1. 根据现有滤色块或激光器进行选择，或者根据新买的染料再重新配一个滤色块； 2. 多色荧光成像时，要尽量避免染料之间的窜色，同时还要避开样品自发荧光的影响； 3. 染料的物理化学性质，优先考虑稳定性和抗淬灭性强的染料，离子荧光染料尽量选择Km值大的染料，对细胞内的离子浓度缓冲作用小； 4. 尽量选择负载后不会改变细胞的生理生化状态，或对细胞无毒副作用的染料； 5. 根据自己的实验需求是染活细胞还是固定细胞，选择相对应的染料，有时还要考虑染料能否经受醛类物质的处理； 6. 包装形式：很多染料厂商会提供粉末和溶液两种形式，尽量选择粉末形式的，粉末的稳定性和保质期一般要比溶液长很多，而且尽量选择多管分装的粉末。 7. 厂商选择：如果经费充足的话就首选MP的吧，其次再考虑Sigma，Roche等其他公司，国产知道的有碧云天，凯基等等。 （二）、荧光染料配制及操作注意事项 1. 详细阅读厂商提供的说明书，了解该染料的详细信息，严格参照操作指南进行配制； 2. 如果是多管分装的粉末，每次配一管，配成适当高浓度的母液，然后再分装成几小管，每管10~20微升，小管封口，避光，低温保存，尽量避免反复冻融，每小管依照次序用完后再另开新的小管； 4. 用母液配制的工作液尽量现配现用，染色过程尽量避光； 5. 第一次使用某染料时，必须根据说明书或参考文献，进行染色浓度和染色时间摸索，以确定最佳染色条件； 6. 为了增强染料的负载效率，可适当进行抽真空，或者添加微量的表面活性剂（如0.005% silwet，Triton X-100等等）； 7. 染完色后，用培养液或缓冲液洗涤几次，以降低背景荧光强度； 8. 染色完成后及时进行观察，适时使用些抗淬灭剂以增强染料的光稳定性。 三、荧光滤色块类型的选择 荧光滤色块（Filter cube），又称荧光滤片组（Filter set），一个完整的荧光滤色块由激发光阻滤片，发射光阻滤片和二向色镜（分色镜）三部分组成，模块侧面标有这三块滤色片的光谱参数（图6，图7）。  图6. 荧光滤色块构造，45度斜躺着的是二向色镜  图7. 荧光滤色块构造，左侧面是激发光阻滤片，上顶面是发射光阻滤片 图8展示的是Observer Z1中的六孔荧光转盘，其中两点，八点，十点和十二点钟方位分别装有一个荧光滤色块，四点钟方位装着DIC模块，空着的六点钟方位是来看明场和相差的。使用时通过转动转盘来进行观察模式切换。  图8. Observer Z1中的六孔荧光转盘 光线在荧光滤色块中的传播光路（图9）：反射光阻滤片只允许光源中特定波长的光线透过，这部分激发光到达二向色镜时被反射后通过物镜照射到样品上，样品中的荧光基团被激发光激发，发射出长波长的荧光；发射光通过物镜，透过二向色镜，到达发射光阻滤片，此时又只有特定波长的光线透过，最后通过目镜被我们肉眼看到的就是样品中的荧光了。  图9. 荧光滤色块中的光路示意图 再来看看荧光滤色块的光谱参数图（图10）。横坐标是波长（nm），纵坐标是透光率（%），图中的曲线从粗到细依次代表激发光阻滤片，发射光阻滤片和二向色镜对不同波长光线的透过率。滤色片有带通(bandpass，简称BP)和长通(longpass，简称LP)之分。带通滤色片参数有多种书写格式，如图10中Filter set（后面缩写为Fs）46中的“BP 500/20”表示此滤色片只透过500nm前后总共20nm光谱带中的光线，有时也会写成“BP500±10”或者“BP490-510”，其实意思都是都是一样的；“LP590”就表示波长长于590nm的光都能透过，“FT 515”则表示波长短于515nm的光被分色镜反射，波长长于515nm的光可以透过分色镜，有些厂商会写成“DM 515”。普通荧光显微镜一般配的都是带通的，共聚焦上一般会配几个带通和一个长通的。带通的滤色块一般只能看到单一颜色的荧光，所以荧光显微镜一般配备的都是黑白CCD，拍出灰度照片后再加上假颜色，而且黑白CCD的灵敏度要比彩色CCD的灵敏度要高很多；而长通滤色块能同时看到多色荧光，一般用彩色CCD成像，或者像配在共聚焦上，只用来观察不用来直接成像。  图10. 荧光滤色块的光谱参数图 带通滤色片根据透过光线的光谱带宽窄（即图10中参数斜杠后面的数字），又相对地可分为宽带通与窄带通两类，如图10中的四个滤色块都是用来看绿色荧光的，Fs 38和Fs 38 HE的激发光和发射光带通为40nm和50nm，而Fs 46和Fs 46 HE的激发光和发射光带通为20/25nm和30nm，所以相对而言，Fs 38和Fs 38 HE是宽带通滤色块，而Fs 46和Fs 46 HE是窄带通滤色块。另外还要注意滤色片的透光率，蔡司滤色块编号中带有“HE”字母的采用的是高效荧光滤色片，透光率能达到90%（图10右），而普通的滤色片透光率只停留在70%~80%（图10左）。 现在就用实际样品来比较一下带通宽窄和透光率对成像的影响，测试方法是用图10中的四个滤色块在相同激发光强度，相同曝光时间来对同一视野进行拍照，比较成像效果。首先采用的是发绿色荧光的活细胞染料FDA，样品是拟南芥原生质体（图11）。对比图11中的荧光强度可以看出，宽带通（Fs 38和Fs 38 HE）要强于窄带通（Fs 46和Fs 46 HE），高透光率的（Fs 38 HE和Fs 46 HE）要强于普通的滤色块（Fs 38和Fs 46）。  图11. 四组滤色块对拟南芥原生质体FDA染色成像对比 宽带通滤色块的荧光强度亮，会不会有什么负面影响呢？接着我又用了一个表达CFP-YFP的拟南芥原生质体测试了一下Fs 38 HE和Fs 46 HE成像效果（图12）。在宽带通Fs 38 HE中荧光强度较强，窄带通Fs 46 HE中荧光强度很弱，跟图11中的结果类似。综合图11和图12中的结果可知，宽带通滤色块成像荧光强度亮，适用性广，除了能看绿色荧光，必要时还能粗略地看看CFP和YFP样品，这也就意味着它的特异性较差，成像时易受其他杂色荧光的影响；而窄带通滤色块成像荧光强度相比稍微弱一些，但是抗其他杂色荧光的能力强，特异性好，图像信噪比要稍好些。 图12. 两组滤色块对拟南芥原生质体CFP-YFP成像对比 总结一下滤色块类型选配原则吧，为了达到更好的成像效果，对于不同样品滤色块类型选择如表1。这里特别提一下长时间活细胞成像和快速成像，这些实验中最好选用高透光率的荧光滤色块。相比于普通滤色块，获得相同亮度的荧光照片，使用高透光率滤色块成像时所需的曝光时间会短一些，利于快速成像；同理，在长时间活成像过程中，也相应地减少了激发光对样品的照射时间，降低了激发光对荧光染料的淬灭和对细胞的毒性作用。 表1. 适合不同样品成像的滤色块类型选择
四、荧光染料和荧光滤色块之间的组合搭配 前面分别介绍了荧光染料和荧光滤色块的相关知识，现在就来讲讲实验中经常出现在我们面前的两个问题：如何根据自己所用的荧光染料选配合适的滤色块；如何选择适合现有荧光滤色块的荧光染料。 在此之前，再给大家介绍一个在线小工具——“荧光光谱查看器”，还是MP公司的：http://zh./site/cn/zh/home/support/Research-Tools/Fluorescence-SpectraViewer.html。使用这个工具之前，必须先给电脑安装Java插件，下载地址：http://www./zh_CN/。在操作界面（图13）的左下角可以选择相关的荧光基团，选中后这个荧光基团的激发光（虚线）和发射光谱线（实线）就会显示在上方的图中；界面的下中部和右下角可以输入荧光滤色块的激发光和发射光光谱参数，输入后会以带颜色的柱状图显示在上方的图中；界面上方图中的横坐标是波长，纵坐标是相对激发效率或相对透光率；界面右侧是对选中染料的一个简单说明。在光谱图中可以通过框选某一光谱区域进行放大查看，放大后可通过双击返回全貌图。通过这个工具对光谱进行绘制和比较，可以检查多种荧光基团的光谱兼容性及荧光染料与滤色块之间的适配程度。另外，蔡司网站上也有个类似的工具，蔡司工具的长处在于同时整合了染料，光源和滤色块三个数据库，做的更科学更精确，但是只能查看蔡司公司的滤色块，而且图谱显示界面有点复杂，兼容性和直观性不如MP的查看器。 图13. 荧光光谱查看器操作界面 （一）、根据所用荧光染料选择滤色块 大家在写荧光显微镜配置和给显微镜添加新滤色块时一般会碰到这个问题。现在我就以线粒体红色荧光染料MitoTracker Red CMXRos和我们显微镜配有的三个红色荧光滤片为对象，先通过荧光光谱查看器进行比较并推测出与染料最匹配的滤色块，然后再用实际样品来验证我的推测是否正确。先从界面左下角的“Fluorophore”的下拉菜单中选中“MitoTracker Red”，再分三次输入Fs 45（Ex：BP 560/40，Em：BP630/75）, Fs 43 HE（Ex：BP 550/20，Em：BP605/70）, Fs 20（Ex：BP 546/12，Em：BP608/65）三个滤色块的激发光和发射光滤色片的参数，即可得出染料与滤色块的光谱叠加图（图14）。 首先来说说我自己发明的比较方法吧，这里要对两个面积进行比较，第一个是染料激发光光谱曲线（虚线），激发光滤色片柱形图与x轴所围成的面积（SEx），SEx越大，则表明激发光滤色片与染料的适配程度越高；第二个是染料发射光光谱曲线（实线），发射光滤色片柱形图与x轴所围成的面积（SEm），SEm越大，则表明发射光滤色片与染料的适配程度越高，最后再综合出一个总体适配程度。从图14中可以看出SEx大小次序为Fs 45＞Fs 43 HE＞Fs 20，其中Fs 45的SEx是Fs 43 HE的近两倍，Fs 43 HE的SEx是Fs 20的近两倍，三者之间差别巨大，激发光滤色片的适配程度排序为Fs 45＞＞Fs 43 HE＞＞Fs 20。而SEm大小次序为Fs 43 HE＞Fs 20＞Fs 45，但是三者间的SEm差距都很小，三者发射光滤色片的适配程度相当，最好的是Fs 43 HE。再把两个适配程度综合起来比较，推测总体适配程度依次为Fs 45＞Fs 43 HE＞Fs 20。（注：此方法忽略了光源在各个波段能量分布不均一的性质，因此直接通过面积比较得出的只是一个大致的适配程度排序） 图14. MitoTracker Red与Fs 45（左），Fs 43 HE（中），Fs 20（右）滤色块的光谱叠加图 现在就用实际样品来检测我的推测。采用的样品还是拟南芥原生质体，线粒体染料MitoTracker Red CMXRos染色15分钟，拍照时除了选用滤色块不同，其他硬件软件设置都完全一样。图15中的小亮点就是被染上色的线粒体，荧光强度强弱依次为Fs 45＞Fs 43 HE＞Fs 20，与我前面的推测完全一致。但是这里又出现了一个新问题——自发荧光的窜扰。图15中Fs 45图像右上角是个叶肉细胞，叶绿体的自发荧光窜入了荧光通道，荧光信号的特异性大大降低；左下角是个没有叶绿体的表皮细胞，通过Fs 45成像荧光强度高，特异性也很好。综上所述，线粒体染料MitoTracker Red CMXRos对于没有红色自发荧光的表皮细胞或动物细胞来说，三者中最佳配置是Fs 45；而对于有红色自发荧光的植物叶肉细胞，三者中最佳配置是Fs 43 HE。很多时候不能光看参数，需要具体样品具体分析。实验证明通过比较面积的方法得出的结果，可信度还是不错的。 图15. Fs 45，Fs 43 HE和Fs 20滤色块对MitoTracker Red成像效果对比 （二）、根据现有荧光滤色块选择适合的荧光染料 如果荧光显微镜已经买好了，而且也没有经费添置新的滤色块，此时就必须根据现有荧光滤色块来选择适合的荧光染料。还是以选购线粒体红色荧光染料为例吧，例如现在只有一个Fs 45（Ex：BP 560/40，Em：BP630/75）滤色块可用来看红色荧光，而线粒体MitoTracker系列荧光染料在红光附近有Orange，Red和Deep Red三种可供选择，该如何选择呢？其实很简单，方法同上，还是比较SEx和SEm的大小。从“Fluorophore”中选出三种染料，再输入滤色块参数，得出光谱叠加图（图16），从图中可以看出，SEx面积：Orange≈Red＞Deep Red，SEm面积： Red＞Deep Red＞Orange，综合来看，最适合Fs 45的红色线粒体染料是MitoTracker Red。当然，选择染料时除了要与滤色块光谱适配程度高外，还要综合考虑前文中提到的染料其他方面的性质。 图16. MitoTracker Orange，Red，Deep Red与Fs 45滤色块的光谱叠加图 如果大家在实验中碰到了上述类似问题，可以参照我所举的几个例子，举一反三，进行具体分析。以上跟大家分享的就是我这几年来在荧光染料和荧光滤色块选择与搭配方面的一些经验和心得，其中难免会有一些错误或不足，还望大家指正补充。 |
|
|
