【重磅】2018年CLSI文件更新：关于mCIM和eCIM实验

前几天，各大临床微生物专业群又被一年一度的新版CLSI文件刷屏了，

这次的更新版，与往年一样内容非常丰富（此处省略2万字）；

 

2018年CLSI更新：关于mCIM和eCIM实验

一．何时做？

答：基于流行病学或感控目的。mCIM用于检测肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌中的碳青霉烯酶，而eCIM是与mCIM联合使用以区分产金属酶和丝氨酸碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。mCIM可以单独进行实验，但eCIM必须同时和mCIM联合进行实验。仅当mCIM结果呈阳性时，eCIM结果才有效。

二．试剂盒材料

1. TSB肉汤（2ml）

2. 美罗培南纸片（10mg）

3. 1ml和10ml接种环

4. 营养肉汤（如MH、TSB）或生理盐水（3-5ml）

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5. MHA平板（100mm或150mm）

6. 美罗培南敏感菌株-大肠埃希菌（ATCC 25922）

7. 0.5M EDTA（仅用于eCIM）

三．mCIM实验操作步骤

1. 取1ul接种环满环（肠杆菌科细菌）或10ul接种环满环（铜绿假单胞菌）的生长于血琼脂平板上的过夜培养纯菌落，于2ml TSB肉汤中；

2.震荡混匀10-15秒

3. 每管放入一张含10ug美罗培南的无菌纸片，确认纸片浸没于菌悬液中

4. 35℃±2℃大气环境孵育4小时±15分钟

5. 孵育结束时，立即用营养肉汤或生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希ATCC 25922菌悬液（直接菌悬法）

6. 菌悬液制备和平板涂布必须15分钟内完成，干燥3-10分钟；

7. 用10ul接种环将美罗培南纸片从TSB肉汤中取出，将纸片贴于试管内壁，轻轻按压以挤去纸片上多余水分，然后将纸片取出贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上。100mm的MHA平板最多贴4张纸片，150mm的MHA平板最多贴8张纸片。

8. 倒置平板，35℃±2℃大气环境孵育18-24小时

9. 量取抑菌圈直径

四．eCIM实验操作步骤

1. 取第二支含2ml TSB的肉汤管，管壁上标记细菌名称；加入20ul 0.5M EDTA溶液于2ml TSB中，EDTA最终浓度为5mM；

2. 剩下步骤同mCIM实验步骤1-9。mCIM和eCIM实验同步进行；

3. mCIM和eCIM实验管中的美罗培南纸片贴于同一块已涂布有大肠埃希菌ATCC 25922的MHA平板上。

五．结果解释之mCIM

1. 碳青霉烯酶阳性：美罗培南抑菌圈直径为6-15mm 或直径为16-18mm但抑菌圈内有散在菌落。若待测株产生碳青霉烯酶，纸片中的美罗培南被该酶降解，结果为无抑菌圈或抑制大肠埃希菌ATCC 25922的活性降低；

2. 碳青霉烯酶阴性：抑菌圈直径≥19mm。若待测菌株不产碳青霉烯酶，纸片中的美罗培南不被水解，仍能抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长；

3. 碳青霉烯酶中性：抑菌圈直径为16-18mm，或直径为≥19mm但抑菌圈内有散在菌落。无法判断是否存在碳青霉烯酶；

图1. 10ul接种环取出美罗培南纸片（a）；将纸片贴于试管内壁并挤去多余水分（b）；同一接种环取出纸片（c）将纸片贴于已涂布有大肠埃希菌ATCC25922的MHA平板上；

图2a. 阴性对照肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706（A）和阳性对照肺炎克雷伯菌ATCCBAA1705（B）

图2b. 碳青霉烯酶产生株。备注：mCIM结果阳性

六．结果解释之eCIM

1. 金属酶阳性：与mCIM结果相比，美罗培南抑菌圈直径≥5mm（如mCIM=6mm，eCIM=15mm，抑菌圈直径之差为9mm）。对于eCIM，忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落。若待测株产生金属酶，与不含EDTA管相比，该酶活性将被EDTA抑制，纸片中的美罗培南未被细菌产生的金属酶充分水解，美罗培南仍能抑制大肠埃希菌ATCC 25922的生长，进而出现抑菌圈；

2. 金属酶阴性：与mCIM结果相比，美罗培南抑菌圈直径≤4mm（如mCIM=6mm，eCIM=8mm，抑菌圈直径之差为2mm）。对于eCIM，忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落。若待测株产生丝氨酸碳青霉烯酶，该酶活性将不受EDTA影响。含与不含EDTA管美罗培南的抑菌圈直径无差别或≤4mm。

图3a. mCIM和eCIM结果解释：

A: mCIM阴性（抑菌圈直径=20mm）；B：eCIM无效结果；

当mCIM结果为阴性时，不解释eCIM结果，因为碳青霉烯酶检测为阴性。

图3b. mCIM和eCIM结果解释: mCIM和eCIM阳性。

A：mCIM阳性 (抑菌圈直径为6mm）；B：eCIM阳性 (抑菌圈直径 = 15 mm，忽略抑菌圈内有针尖样散在菌落)。

报告：金属酶检测阳性

图3C. mCIM和eCIM结果解释: mCIM和eCIM阳性。

A：mCIM阳性 (抑菌圈直径为6mm）；B：eCIM阳性 (抑菌圈直径 = 19 mm，忽略抑菌圈内有针尖样散在菌落)。

报告：金属酶检测阳性

图3D. mCIM和eCIM结果解释: mCIM阳性但eCIM阴性。

A：mCIM阳性 (抑菌圈直径为6mm）；B：eCIM阴性 (抑菌圈直径 = 6 mm)。

报告：丝氨酸碳青霉烯酶检测阳性

七．报告：如下表所示。

仅mCIM
mCIM结果	eCIM结果	报告
阴性	无	碳青霉烯酶阴性
阳性	无	碳青霉烯酶阳性
中性	无	无法判断是否存在碳青霉烯酶，建议实验室讨论；
mCIM和eCIM联合实验
mCIM结果	eCIM结果	报告
阴性	不解释	碳青霉烯酶阴性
阳性	阴性	丝氨酸碳青霉烯酶
阳性	阳性	金属酶
中性	不解释	无法判断是否存在碳青霉烯酶，建议实验室讨论；

八．注释

1. 中性结果：（1）检查待测菌株和大肠埃希菌ATCC 25922的纯度；（2）检查美罗培南的质控结果；（3）重复mCIM和/或eCIM实验；

2. 仅mCIM实验：某些菌株可能出现美罗培南抑菌圈内出现散在菌落，若抑菌圈直径为6-18mm，结果判定为碳青霉烯酶阳性；若抑菌圈直径≥19mm，结果判定为中性结果；

3. 仅eCIM：忽略任何抑菌圈内的散在针尖样菌落。解释结果严格按mCIM和eCIM实验的抑菌圈直径差异进行判断；

4. mCIM阴性但eCIM阳性的结果不应出现。如果出现此种结果，应对质控各环节进行检查，若重复测试结果仍如此，认为实验结果无效；

5. CLSI当前仅对mCIM实验中1 ul满环的肠杆菌科细菌和10 ul满环的铜绿假单胞菌接种菌量进行标准化；

九．质量控制：如下表所示。

质控菌株	细菌特征	预期结果
肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705	KPC阳性，丝氨酸碳青霉烯酶产生株	mCIM阳性，eCIM阴性
肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706	碳青霉烯酶阴性株	mCIM阴性
肺炎克雷伯菌ATCC BAA 2146	NDM阳性，金属酶产生株	mCIM阳性，eCIM阳性

十. 参考文献

1. Tijet N,Patel SN, Melano RG. Detection of carbapenemase activity in Enterobacteriaceae:comparison of the carbapenem inactivation method versus the Carba NP test. JAntimicrob Chemother. 2016;71(1):274-276.

2. van derZwaluw K, de Haan A, Pluister GN, Bootsma HJ, de Neeling AJ, Schouls LM. Thecarbapenem inactivation method (CIM), a simple and low-cost alternative for theCarba NP test to assess phenotypic carbapenemase activity in gram-negativerods. PLoS One. 2015;10(3):e0123690.

3. PierceVM, Simner PJ, Lonsway DR, et al. Modified carbapenem inactivation method(mCIM) for phenotypic detection of carbapenemase production amongEnterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 2017;55(8): 2321-2333.

4. CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed.CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute;2018.

来源：微生物之家

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