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【转载自实验室万事屋】 刚进实验室不久的你，或者已经进来多半会儿了的你，也许会和我有差不多的遭遇，就是需要看懂质粒图。当然土豪实验室可以包给外面的公司，但我们不行。因为老板觉得包给外面公司太不靠谱了，于是就叫我们自己构建。 我看到的质粒图是这样的：
还有这样的：
或者还有这样……
在我眼里其实是这样的：
好了，我已经脑积屎了。好吧，有困难靠师姐是万事屋的原则。所以，师姐，你赶紧给我讲一下吧！ 首先，第一步，看箭头：
大多数质粒都会有箭头，箭头有两种解释。一种是转录方向，转录方向主要是由启动子开始的一个大箭头，是启动子启动序列的顺序。另一种是复制起始位点的方向，复制起始位点就是该质粒在大肠杆菌等细菌或真菌中DNA复制的一个方向。我们还需要提到的是F1启动子（图上的f1 ori）代表的是噬菌体的复制起始方向，只能复制出单链的DNA哦，但是可以用来测序。看懂转录的方向，这样就方便设计插入片段的位置和方向性。 第二步，看上面的标签。
还是那张图，这张图是一个酵母双杂的BD质粒图片。上面的标签我们可以得到很多具体信息，标签上会显示这样的内容： 1）ori：DNA 复制起始位点，一般在大肠杆菌中是pUC类的，其实不是很重要。 2）P：这个一般是代表启动子，这个质粒上用的是一个CMV启动子，来启动后面的表达蛋白。常见的启动子有：CMV、EF1（这俩是启动长片段的），H1、U6（启动短片段的，比如shRNA），35S、2×35S（做植物的应该懂的）。 3）r：有很多抗性基因，会在后边加上R，最常见的是：Amp（氨苄青霉素，常用）、Kan（卡那霉素，常用）、Tet（四环素，tet on/tet of）、Cmr（氯霉素，某些酵母表达质粒）、SM（链霉素）、Hyg（潮霉素，农杆菌里常用的），看清楚抗性，才能不用错，否则是长不出克隆的。 4）pA：这个应该不用太多解释了，这个就是转录终止位点poly A。 5）报告基因：通常会有一两个蛋白，被用作报告基因，比如常见的copGFP（绿色荧光蛋白），Puro（嘌呤霉素），Lacz（乳糖操纵子）等等。和抗性基因不同，这样的报告基因，并不是为了在大肠杆菌扩增质粒的过程中起作用的。而是在质粒转入表达体系后起到作用的，基本上就是为了显示过表达或是敲减的基因是否正常运作。有的报告基因会融合在蛋白中表达，有的会另外用一个独立的启动子进行表达（比如shRNA的质粒中）。 6）其他：至于其他，一般就是一些调控元件和所表达的蛋白了。 第三步，看多克隆位点：
MCS（Multiple Cloning Site，也就是多克隆位点），一般图中会把多克隆位点上的酶切位点都标记出来。上面的酶切位点顺序，一般都是按照5`-3`的顺序排列下来的，需要注意的是这样几点。 第一点是要注意，酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点，也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。 第二点需要注意的是，有的酶切位点，在序列中只有一个，但它上面也会标注一个*或者（dam），这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰[常见的是XbaI，TCTAG(6m)A中的TC无法切开]，一般也是不能用的。但是非要用这个酶切位点的话，就需要用非甲基化的感受态细胞，如JM109或者JM110。 第四步，看多克隆位点的序列：
多克隆位点一般会有上图这样的序列，也就是三联体密码加上酶切位点标示的序列。这里的三联体密码，主要是为了提示你，插入的表达的片段，需要按照这样的三联体进行插入，不要有移码突变。5`末端如果有差异的话，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替换1-2个碱基（变成GTG或者GCG这样），从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。而配合扩增和酶切的话，插入片段是允许有3`末端的冗余。为了可以应付3`末端的冗余碱基，在多克隆位点序列后，会有译码的终止TAA密码，即使插入的片段使得3`末端产生了移码突变，照样能使表达的蛋白正常终止掉（在酵母双杂的AD质粒中，由于插入的是随机cDNA，所以AD的载体上会常见这样的结构）。 |
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