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蓝瑞隆 傅冷西 陈瑞庆 王生淋 施开  【摘要】 目的 通过检测程序性死亡因子配体1（PD-L1）在骨肉瘤组织中的表达，探讨其与骨肉瘤患者临床特征及预后的相关性。方法 选取2006年1月至2012年12月，福建医科大学附属第一医院初诊为骨肉瘤并接受手术切除术的72例患者为研究对象，收集经病理确诊的患者骨肉瘤石蜡标本，采用免疫组织化学（ＩＨＣ）方法检测组织中PD-L1的表达，以PD-L1肿瘤细胞表达超过5％ 为阳性。同时收集患者的临床资料，进行统计学分析。结果 在72例骨肉瘤组织样本中，22例（30.6％）呈PD-L1阳性。PD-L1的表达与患者年龄、性别、肿瘤位置以及肿瘤大小无相关性（P均＞0.05）。单因素分析结果表明，患者的年龄、性别、肿瘤位置和肿瘤大小均与无进展生存（ＰＦs）和总生存（0s）中位时间无关（P均＞0.05）；接受新辅助化疗患者的ＰＦs中位时间（68.0个月，95％CI33.8～102.2个月）和0s中位时间（68.0个月，95％CI34.6～101.4个月）均长于未接受新辅助化疗患者（22.0个月，95％CI16.8～27.2个月；30.0个月，95％CI20.6～39.4个月）（P均＜0.05）；PD-L1阳性骨肉瘤患者ＰＦs中位时间（10.0个月，95％CI0.0～20.7个月）和0s中位时间（28.0个月，95％CI11.1～45.0个月）均短于PD-L1阴性患者（44.0个月，95％CI21.0～67.0个月；52.0个月，95％CI31.4～72.6个月）（P均＜0.05）。多因素分析结果显示：肿瘤大小是骨肉瘤患者ＰＦs期的独立影响因子（P＜0.05）；是否接受新辅助化疗以及肿瘤是否为PD-L1阳性均是骨肉瘤患者ＰＦs期和0s期的独立影响因子（P均＜0.05）。结论 骨肉瘤患者中部分肿瘤呈PD-L1阳性，是否接受新辅助化疗以及PD-L1是否阳性均是骨肉瘤患者预后不良的独立影响因子。阻断程序性死亡因子（PD1）／PD-L1的免疫疗法可能是PD-L1阳性骨肉瘤患者可选择的新型治疗方式。 【关键词】 程序性死亡因子配体1；免疫组织化学；骨肉瘤；预后  骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，儿童和青少年好发［1］。新辅助化疗和保肢术虽大大提高了骨肉瘤患者的生存期，但该病预后仍不理想［2］，其5年生存率仅为60％～70％，而发生转移患者的5年生存率只有约20％。因此，探索新型诊疗手段对改善骨肉瘤预后具有要意义。 肿瘤免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第4大治疗手段。近些年，以阻断程序性死亡因子1（PD1）及其配体（PD-L1）为代表的肿瘤免疫治疗发展迅猛，在许多实体肿瘤治疗中已经取得较好的临床疗效。PD1是一种免疫抑制性受体，主要在活化的Ｔ 细胞、ＮＫ 细胞和Ｂ细胞上表达，它能够与其2个配体即PD-L1和ＰＤ Ｌ2相互作用。PD-L1在许多人实体肿瘤（肾癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤以及乳腺癌等）中均呈过表达，并且往往伴随预后不良［3 9］。正常情况下，PD1／PD-L1是负免疫共刺激分子，在维持机体免疫反应稳态方面起着至关重要的作用。然而，这种稳态在肿瘤微环境中被破坏。PD1在肿瘤浸润淋巴细胞中过表达，而肿瘤细胞则高表达PD-L1，这将不可避免地导致PD1／PD-L1信号转导通路持续激活，从而使肿瘤浸润性PD1阳性的ＣＤ4＋ 和ＣＤ8＋Ｔ 淋巴细胞失活，导致淋巴细胞功能障碍，降低淋巴细胞的抗肿瘤作用。 文献报道，肿瘤组织PD-L1阳性是预判患者对PD1／PD-L1靶向治疗反应较好的重要依据［3，10 11］。近些年，许多大型医药公司均加入靶向PD1或PD-L1单克隆抗体药物的开发，并率先在晚期黑色素瘤、胃癌、头颈部癌等实体瘤患者中开展临床试验。迄今的研究结果表明，阻断PD1／PD-L1信号转导通路已经在许多实体瘤中显示出较好的抗肿瘤作用［3 9］。另据Ｚｈｅｎｇ 等［12］报道，PD1在骨肉瘤患者的外周ＣＤ4＋ 和ＣＤ8＋Ｔ 细胞上均显著上调。但是，PD-L1在骨肉瘤中表达的相关研究十分有限。因此，本研究将采用免疫组织化学（ＩＨＣ）方法检测人骨肉瘤组织PD-L1的表达，收集临床资料并行统计学分析，判断PD-L1与患者临床特征的关系，并探讨其与骨肉瘤预后的相关性，以期为针对骨肉瘤患者的靶向PD1／PD-L1免疫治疗提供依据。 1.1 实验材料 主要试剂：兔抗人PD-L1单克隆抗体（aｂ174838）购自英国Ａbcam公司，IHC方法涉及的其他试剂均购自福州迈新公司。 1.2 骨肉瘤组织蜡块及临床资料收集 选取2006年1月至2012年12月福建医科大学附属第一医院初诊为骨肉瘤并接受手术切除术的72例患者为研究对象，手术切除的72 例骨肉瘤石蜡包埋组织块用于ＩＨＣ 检测。通过查阅病历和电话回访收集研究对象的临床资料，包括年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小以及是否接受新辅助化疗等。随访截止时间为2014年12月31日。本研究已获得福建医科大学附属第一医院伦理委员会批准，并取得研究对象或其家属的知情同意。 1.3 IHC检测 IHC检测按照已有研究报道的方法［13］进行，操作简述如下：组织切片机将骨肉瘤石蜡包埋组织块切成4μｍ 切片，将切片脱蜡并在3％ 过氧化氢（Ｈ202）中孵育12ｍin，后用ＰＢs洗涤5ｍin／次×3次；将切片与兔抗人PD-L1单抗（1∶100稀释）于4℃孵育过夜；用ＰＢs洗涤5ｍin／次×3次，再用带辣根过氧化物酶的羊抗兔ＩｇＧ 室温孵育1ｈ，ＰＢs洗涤5ｍin／次×3 次。根据说明书使用ＤＡＢ 底物显色试剂盒进行底物显色。将切片用苏木精复染1ｍin，然后将玻片脱水并盖上盖玻片。采用二分法鉴定PD-L1的表达（由2位病理科医师独立盲法完成），显微镜下随机挑选5个视野，PD-L1肿瘤细胞表达超过5％的病例被认为是阳性，否则为阴性。 1.4 评估指标 评估指标包括：无进展生存（ＰＦs）时间，表示患者初诊时无转移，从诊断之日起至复发或死亡发生之日为止；总生存（0s）时间，表示从患者初诊日至死亡日止。 1.5 统计分析 采用sＰss统计软件22.0版行统计学分析。χ2检验用于确定PD-L1的表达与各临床特征的相关性，采用Ｋａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ及Ｌ0ｇｒａｎｋ 法行单因素生存分析，Ｃ0ｘ 比例风险模型行多因素分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。 2.1 研究对象基本情况研究对象共72人，年龄11～75岁（中位年龄20岁），＜18岁者为37.5％（27例），41.7％（30例）为女性；66.7％ 的肿瘤（48例）位于股骨或胫骨，其他部位（股骨、肱骨、颌骨等）占33.3％（24例）；肿瘤直径＜5ｃｍ 者占22.2％（16例），≥5ｃｍ 者为77.8％（44例）；61.1％的患者（44例）接受过新辅助化疗；0s中位时间为45.0个月（95％CI31.6～58.4个月）。 2.2 ＩＨＣ 检测PD-L1ＩＨＣ检测骨肉瘤组织中PD-L1表达结果显示，部分骨肉瘤组织的细胞膜和细胞质呈棕色（ＤＡＢ 底物在辣根过氧化物酶的催化作用下呈棕色），见图1。本研究72个样本中，22例（30.6％）PD-L1阳性。 2.3 PD-L1表达与骨肉瘤患者临床特征的相关性患者的年龄、性别、肿瘤位置及肿瘤大小与PD-L1表达均无相关性（P均＞0.05），见表1。 2.4 骨肉瘤患者预后的单因素和多因素分析研究对象的ＰＦs中位时间42.0个月（95％ CI24.8～59.2个月），0s中位时间45.0个月（95％CI31.6～58.4个月）。单因素生存分析结果显示：患者的年龄、性别、肿瘤位置和肿瘤大小均与ＰＦs和0s中位时间无相关性（P均＞0.05）；与未接受新辅助化疗患者相比，接受新辅助化疗患者的ＰＦs中位时间和0s中位时间均更长（P均＜0.05）；与PD-L1阴性患者相比，PD-L1阳性患者的ＰＦs中位时间和0s中位时间均明显缩短（P均＜0.05），见图2、下页图3及下页表2。 多因素分析结果显示：肿瘤大小是骨肉瘤患者ＰＦs的独立影响因子（P＜0.05）；是否接受新辅助化疗以及肿瘤是否为PD-L1阳性均是骨肉瘤患者ＰＦs和0s的独立影响因子（P均＜0.05），见下页表3。 骨肉瘤是较常见的恶性骨肿瘤，近年来骨肉瘤患者的生存率和生活质量均取得较大进步，但仍不能令人满意［14 15］。骨肉瘤的肿瘤大小与疾病进展呈一定相关性，但本研究多因素分析结果显示，肿瘤大小只与ＰＦs时间相关，而与0s时间无相关性。该结果可能与本研究的样本量有关，有待加大样本量进行进一步的研究证实。使用新辅助化疗对骨肉瘤患者的预后有较大程度改善。本研究也表明，接收新辅助化疗能显著提高骨肉瘤患者的生存期，而如何优化新辅助化疗方案可能也是改善骨肉瘤患者预后的关键。 ＩＨＣ技术已广泛用于检测许多实体肿瘤PD-L1的表达，PD-L1是否阳性是评判PD1／PD-L1靶向免疫治疗是否有效的重要依据［8］。有研究表明，PD-L1在胸腺上皮癌、胃癌和肾上腺皮质癌等肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中呈阳性［8，16 17］。我们的研究结果显示，部分骨肉瘤组织中（30.6％）可以检测到PD-L1表达，这与sｈｅｎ等［18］的报道相似。我们发现，PD-L1的表达与患者年龄、性别以及肿瘤位置等无相关性；Ｃ0ｘ回归行生存分析表明，PD-L1阳性是骨肉瘤患者预后的独立影响因子。 综上，阻断PD1／PD-L1信号转导通路可能是PD-L1阳性骨肉瘤患者可选择的新型治疗方式。在本研究中，我们发现PD-L1阳性可作为预测骨肉瘤患者预后不良的独立指标，这为PD-L1阳性骨肉瘤患者行PD1／PD-L1靶向免疫治疗提供了依据。但也有证据表明，缺乏PD-L1表达的部分肿瘤患者仍然可受益于这种免疫治疗［19］，因此需要进行较大样本的检测，并进行相关的临床试验才能得出更为严谨的结论。 |
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