【原】共表达CD39、CD103和PD-1的肿瘤浸润性淋巴细胞在卵巢癌中的单细胞特征及其对预后的影响

健明 2022-09-29 发布于广东

展开全文

文章信息

文章题目：Single-cell Profiles and Prognostic Impact of Tumor-Infiltrating Lymphocytes Coexpressing CD39, CD103, and PD-1 in Ovarian Cancer
期刊：Clinical Cancer Research
影响因子: 13.801（Q1）
发表时间：2021/5/7
DOI：https:///10.1158/1078-0432.CCR-20-4394

文献概述

问题：肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）与大多数癌症密切相关。驱动这种预后效应的细胞亚群仍不清楚。CD39，CD103和PD-1可作为各种癌症中肿瘤反应性CD8⁺ TIL的标志物。高级别浆液性卵巢癌（HGSC）需要更有效的免疫治疗，评估TIL在HGSC中表达这些标志物的各种组合的表型和预后意义。

方法：通过流式细胞术、单细胞测序和化疗前/化疗后HGSC标本的多色免疫荧光评估CD39、CD103、PD-1和其他免疫标志物的表达。

结论：CD39、CD103 和 PD-1 的共表达可划分高度活化的 CD8⁺ 和 CD4⁺ TIL，推断其在细胞溶解、体液和调节免疫功能中的作用。CD39，CD103和PD-1阳性的 TIL 具有特殊的预后意义，并表现出令人信服的联合免疫治疗的靶点。

实验结果

1. CD39⁺ CD103⁺ PD-1⁺ TIL的细胞表型

确定了五个主要细胞簇：CD8⁺ T细胞，CD4⁺ T细胞，自然杀伤（NK）细胞，B细胞和骨髓细胞。绝大多数（75.7%）的CD39⁺ CD103⁺ PD-1⁺ 细胞（以下简称“三阳性细胞”）位于CD8⁺ T细胞簇内，少数（9.9%）在CD4⁺ T细胞簇中，而在NK，B或骨髓细胞簇中罕见或不存在。

在CD8⁺ TIL中，三阳性细胞比例较高（34.8%），其次是三阴性细胞（中位数：23.4%）。与TIL相比，健康供体PBMC中CD4⁺ 和CD8⁺ T细胞主要是三阴性细胞。

TIL中与T细胞活化和耗竭相关的其他细胞表面标志物，三阳性 CD8⁺ TIL 显示 CD69、HLA-DR、CD25、TIGIT 和 TIM-3 的高表达，CCR7、CD45RA 和 CD127 的表达较低。相比之下，三阴性CD8⁺ TIL的HLA-DR，TIGIT和TIM-3表达较低，CCR7和CD45RA的表达更高。CD4⁺ TIL也类似。对于CD8⁺ 和CD4⁺ TIL，PD-1表达的强度在三阳性亚群中最高。因此，三阳性T细胞表现出更活化的终末分化的效应状态。

2. 三阳性TIL的分子表型

使用单细胞测序来确定从六例CD8⁺ TIL和B/浆细胞中分离出的活肿瘤相关CD45⁺ 细胞的基因表达模式和TCR库。除患者s5髓系细胞占主导地位外，T细胞在其他病例中均占主导地位。

T细胞的重聚类分为五个CD8⁺ T簇（CD8.1至CD8.5），三个CD4⁺ T簇（CD4.1至CD4.3）和两个CD4⁺ Treg簇（Treg.1和Treg.2）。

根据CD8.1至CD8.3簇中典型活化（例如IFNG，CD63和几个HLA-DR/DP基因）和耗竭（LAG3，PDCD1）标记物的表达分为活化（CD8.1至CD8.3）或未活化（CD8.4至CD8.5）。虽然所有CD8簇的PRF1，GZMA和GZMM均呈阳性，但它们在其他细胞毒性分子的表达方面存在显著差异：CD8.1至CD8.3主要表达GZMB。相比之下，CD8.4主要表达GZMK，CD8.5主要表达GNLY。鉴于细胞毒性基因在T细胞分化过程中发生变化，这些CD8簇可能代表从终末分化（CD8.1）到未分化（CD8.5）效应细胞的连续体。CD8.2是唯一强烈表达IFN刺激基因（IFIT1，IFIT2，IFIT3和IFITM1）的细胞群，这些基因与抗病毒反应相关，表明这些细胞可能是“旁观者”T细胞。

根据单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，三阳性细胞代表的T细胞比例（中位数：3.5%）低于流式细胞术（中位数：20.9%），这可能反映了蛋白质与基因表达之间的相关性差或流式细胞术的敏感性更高。

通过差异基因表达分析，三阳性CD8⁺ TIL的活化表型比三阴性细胞显著更高，如HLA-DP / DQ / DR，CD74，CD63和IFNG的上调，也表达GZMB，显示出多个衰竭相关基因的上调，例如LAG3，TNFRSF18（GITR），TIGIT和CTLA4，以及TOX（一种与衰竭相关的转录因子）的上调。三阳性细胞也显示出几种趋化因子的表达升高，包括CXCL13，CCL3和CCL4，分别吸引B细胞和浆细胞样树突状细胞到肿瘤部位。

三阴性 CD8⁺ TIL 细胞表达GZMK，还参与细胞因子/趋化因子信号传导（IL7R、CXCR4、IL32）、GTP 结合蛋白（GIMAP4 和 GIMAP7）、RNA 处理和翻译（RPL13、EEF1A1）和基因调控（ZFP36L2、FOS、JUNB）。

预计肿瘤反应性T细胞将显示克隆性扩增的证据。事实上，与三阴性细胞相比，三阳性和“其他”CD8⁺ TIL显著富集于扩增TCR克隆型。三阳性CD8⁺ TIL的TCR库的多样性低于三阴性细胞。符合差异基因表达分析，三阳和双阳性CD8⁺ T细胞的TCR库显示出比单阳性或三阴性细胞更多的重叠。

与三阴性CD8⁺ TIL类似，三阳性Tregs比三阴性Tregs显示的更活化，增殖和耗竭的表型，如TNFRSF1B(TNFR2), TNFRSF9(4-1BB), and TNFRSF18(GITR), and glycolysis-associated genes such as GAPDH, ENO1, LDHA, PGAM1, and PKM 的上调。“其他”Tregs与三阳性Tregs非常相似，只有一个基因LGALS1在三阳性细胞中显著上调。

3. CD39⁺CD103⁺PD-1⁺ TIL的免疫学和临床相关性研究

使用5色的 IF panel (CD39, CD103, PD-1, CD8, and PanCK)染色HGSC样品。CD39⁺ CD103^- PD-1^- CD8^- 细胞在上皮中较多，可能是髓系细胞。在上皮CD8⁺ TIL中，最常见的表型（按顺序）是CD39^- CD103⁺ PD-1⁺ ，三阴性，CD39^-CD103⁺ PD-1^- 和三阳性细胞。大多数表达CD39的CD8⁺ T细胞对CD103和PD-1也呈阳性（中位数：66.7%）。虽然IF和流式细胞术数据基本一致，但IF检测到三阳性细胞的表达较低，可能是流式细胞术是在大量肿瘤样本上进行的，而IF仅限于上皮。

IF分析显示，新辅助化疗后上皮CD8⁺ TIL显著增加。同样，化疗后三阳性TIL增加。这种增加与CD8⁺ TIL的增幅成比例，表明新辅助化疗不会优先增加三阳性亚群。

对197例原发性HGSC样本队列的进一步分析显示，三阳性CD8⁺ TIL与肿瘤分级，分期或患者年龄无关。然而，高水平的三阳性CD8⁺ TIL与DSS密切相关，与在CD8⁺ TIL阳性中的比例有关。

评估CD39的作用

分组

（i）三阳性CD8⁺ TIL，
（ii）CD39^-CD103⁺PD-1⁺CD8⁺ TIL，
（iii）其他CD8⁺ TIL
（iv）无CD8⁺ TIL。

与所有其他组相比，三阳性CD8⁺ TIL的肿瘤患者的生存期显著延长。

三阳性CD8^- TIL与延长生存期密切相关。此外，与高|低、低|高或低|低的患者相比，CD8⁺和CD8^-三阳性细胞水平高的患者(即高|高的患者)生存时间显著延长。

总结

评估了CD8⁺和CD4⁺ TIL中共表达CD39、CD103和PD-1及其组合在HGSC中的表型和预后价值。
仅在肿瘤样本中检测到三阳性细胞，无论其CD8⁺ 或Treg状态如何，与三阴性细胞相比，三阳性细胞都显示出强烈的活化/耗竭表型。三阳性CD8⁺ TIL与肿瘤MHC I表达呈阳性相关，并且在新辅助化疗后增加。
三阳性T细胞作为免疫疗法重激活或增强的细胞类型值得进一步研究。
PD-1，CD39和TIGIT途径的联合拮抗可能是增强HGSC和相关恶性肿瘤中三阳性CD8⁺ TIL活性的有效手段。