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又到一年开学季，高校各大实验室又涌进来一波波的小哥哥，小姐姐。对于初来乍到的小鲜肉来说，除了练好插枪头的基本功外，其次就是跑好westernblot了。平时在实验室中，经常会听到一些小师弟小师妹在抱怨：“为什么好看的westernblot条带都是别人家的，而我的条带跑得跟shi一样”？今天小编就带大家一起来探讨跑好wb的几条秘籍。 1. 选择好的抗体 众所周知，wb的基本原理就是利用抗体与抗原的特异性结合，来检测特定蛋白的表达。所以，首先要选好的抗体。选抗体尽可能找一些靠谱的大品牌公司的抗体(如abcam,CST,Sigma)。 下面我们介绍一个网站——Citeab来说明下抗体的选择。 网址：https://www./ 打开以后我们可以输入要检索的基因名字，比如foxo3a： 我们可以在左侧选择一抗/二抗、单抗/多抗、物种、应用技术、修饰、厂家等，比如我们选择WB: 在文章右侧就会出现对应的信息：在每个产品右侧会有citations的数量，比如第二个: 我们可以直接单击View PDF查看使用这个抗体发表的文章： 2. 制备合格的样品 制备合格的的样品，是成功的一半。裂解液的选择也是关键（裂解液的选择参考下表）。如果要提取做IP,coIP的蛋白样品的话，则需要选取不含SDS的裂解液。在抽提蛋白时，要在裂解液中添加蛋白酶抑制剂，如果检测的磷酸化蛋白，则要在裂解液中添加磷酸化酶抑制剂，并且要在冰上操作，避免蛋白降解。为了充分裂解样品，也可以选用超声处理细胞或组织样品，超声能充分破碎细胞膜和剪切DNA。但如果提取用于做IP的样品，则不建议用超声处理样品。 3.胶要均匀，且浓度合适 选择合适的胶浓度并胶要配均匀（PAGE胶浓度的分离范围如下表）。胶如果配得不均匀的话，跑出来的条带可能不齐或出现“微笑”“哭脸”状条带。要让条带跑得漂亮些的话，可以提前配好胶块，用水打湿纸巾将胶板包起来放四度冰箱过夜，第二天再跑胶。
4.选择合适的电泳电压 电泳的电压要合适，电压过高容易导致电泳液和胶发热。一般选择60-80V跑浓缩胶，而选用100-120V跑分离胶。 5.选择合适的膜 现在常用的膜有PVDF膜或NC膜。PVDF膜分辨率高，背景低，具有溶剂耐受性，机械强度高，适合于SDS存在下与蛋白的结合。可用于常规染色，考马斯亮蓝染色，ECL和免疫检测，使用前需用100%甲醇浸泡30秒。NC膜同样具有高灵敏度和低背景的特点，但干的NC膜较脆，无溶剂耐受性，使用前用缓冲液湿润即可。常规染色，可用于放射性和非放射性检测。孔径0.45um的NC膜适用于一般蛋白，蛋白分子量小于20KD则选择0.2um的NC膜。 6. 转膜时间要恰当 转膜时间的长短直接影响到转膜效果。湿转的话，要根据目标蛋白分子量的大小选择合适的转膜时间（参考下表）。若使用Bio-Rad Trans-BlotTurbo System半干转的话，则选择2.5A 转7-15分钟。如果单独半干转一块胶的话，则选用1.5A 转7-15分钟。转膜时注意赶走气泡。
7.选择合适的封闭液 化学发光法：用含5%脱脂牛奶的TBST；荧光法用5%脱脂牛奶的TBS;在摇床上室温封闭1小时。 8. 选择合适的抗体孵育浓度 抗体的孵育浓度直接关系到检测结果。过高容易出现杂带。相反，过低则有可能导致检测到的条带不清晰。抗体具体的稀释浓度参照抗体说明书。一抗一般推荐四度摇床孵育过夜，二抗一般室温孵育1-2小时。 9.洗膜 洗膜一般用TBST洗3次，每次5-10分钟。 10.检测条带 第十：检测。通常有2种方法来检测条带：一种是化学发光，化学发光法是最广泛的检测方法，若二抗上标记的过氧化物酶或辣根过氧化物酶，可以用ECL底物发生氧化还原反应。采用化学发光法检测时，化学发光液A液和B液要现配现用，注意避光。另外一种是荧光法，通过采用合适的荧光标记抗体，结合oddessy仪器，实现多重wb分析。无须加发光液即可检测到条带。
以上这些就是做好wb的一些小tips,小伙伴们，你们get到了么？ |
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