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一、引言 DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失,导致酶切片段大小发生了变化,这种变化可以通过特定探针杂交进行检测,从而可比较不同品种(个体)的DNA水平的差异(即多态性),多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆,位于染色体的不同位点,从而可以作为一种分子标记(mark)构建分子图谱。当某个性状(基因)与某个(些)分子标记协同分离时,表明这个性状(基因)与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小,即表示目标基因与分子标记之间的距离,从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上,可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA后,所切的片段类型不一样,因此,限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ、 BamH I、 EcoR I、 EcoR V、XbI,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多,则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。巢式 PCR-RFLP( nested PCR-RFLP)是将RFLP与巢式PCR技术相结合,通过设计高度保守序列的引物对待检物种DNA进行PCR扩增,对PCR产物进行RFIP分析。该方法省时,可应用于流行病学调查和临床常规检测 二、材料 ①模板:基因组DNA或cDNA ②dNIP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为2.5mmol/L。 ③四条特异引物:两条外引物,两条内引物,浓度均为1 Humor/L ④ Taq DNA聚合酶及其10×PCR缓冲液。 ⑤高压灭菌去离子水 ⑥用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。 ⑦限制性内切酶及其10×缓冲液。 三、方法 (一)巢式PCR 1.引物设计 巢式PCR的引物设计原则与常规PCR相同。通常内引物与外引物的间隔距离也没有统一的要求,具体情况根据每个实验而定。 2.模板 一般使用经过提取的基因组DNA或合成的cDNA 3操作方法 ①设立50的PCR反应体系。在0.25ml的PCR管中,分别加入 10×PCR缓冲液 5ul DNA模板 5ul 2.5mmol/L的dNTP混合液 1 ul Taq DNA聚合酶(5U/l) 0.5ul 10ymol/L的外引物(P1、P2) 各1ul H2O 至50ul 如果PCR仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约50)。将PCR试管放入到PCR仪上。 ②设置PCR反应条件 预变性 94℃, 变性 94℃, 退火 55℃,30s 延伸 72℃,60s 变性-退火-延伸 30个循环 延伸 72℃,7min PCR反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成1000bp左右 ③进行第二轮PCR反应。在0.25ml的PCR管中,分别加入: 10×PCR缓冲液 5ul 第一轮PCR产物 5ul 2.5mmol/L的dNTP混合液 1 ul Taq dna聚合酶(5U/pl) 0.5ul 10mol/L的内引物(P3、P4) 各1ul H2O 至50ul PCR反应条件同第一轮。 ④PCR产物的检测。 反应结束后,用10μ第二轮PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析 (二)PCR产物酶切 当获得第二轮的PCR产物后,选用适当的限制性内切酶,酶切位点的选择要根据已有序列的分析,酶切的反应体系为20l 10×内切酶缓冲液 2pl第二轮PCR反应的产物 10l 限制性内切酶 IOU H2O 至20川 37℃水浴5h。 (三)酶切产物的检测 获得酶切产物后,要根据目的片段的大小选择不同的琼脂糖浓度。因酶切产生的片段能小于100bp,所以用琼脂糖浓度应当比平时高一些,例如2%~5%,如果酶切产生的片段大部分小于500bp,可用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。如果酶切产物的浓度较低,可用杂交的方式来增加灵敏度。 四、注意事项 扩增的基因要选择适合进行RFLP分析的区域,尽量选择常用的限制性内切酶,分型位点不能过于接近。有时出现一些稀有酶的酶切位点,会导致酶切效率下降或费用昂贵。未酶切的DNA要防止发生降解,酶切反应一定要彻底。 五、应用与小结 巢式 PCR-RFLP多用于基因的多态性检测,相对于 PCR-RFLP,通过巢式PCR扩增克服了单次扩增“平台期效应”的限制,减少了模板浓度低、扩增产物过少的问题,所需DNA模板浓度低,1~2ng/μ也能完成检测工作,使扩增倍数大大提高,提高了PCR扩增的产量及敏感性第二次扩增产物较多可直接用于酶切,减少了单次扩增后要经过DNA浓缩这一步,从而减少了DNA在浓缩后对酶切效果的影响 |
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