做磷酸化蛋白的western blot如何事半功倍 ?

本人的研究生实验被western blot承包了，尤其是做磷酸化蛋白上摸爬滚打了这么多年，所以总结下自己的经验，希望能助同道中人一臂之力，少走点弯路，早日出结果发paper, 迎娶白富美，走向人生巅峰！！！

那首先先思考几个问题，什么是蛋白质磷酸化？在哪些位点发生蛋白质的磷酸化呢？发生磷酸化有什么作用呢？下面我们来一一揭晓蛋白质磷酸化的神奇面纱：

Q1: 什么是蛋白质磷酸化呢？

蛋白质磷酸化是在蛋白质激酶催化下，把ATP的磷酸基转移到其他蛋白质氨基酸残基。

Q2: 什么是蛋白质的去磷酸化呢？

上述磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下去磷酸化，这个过程是可逆的图所示

Q3: 蛋白质磷酸化主要发生的氨基酸残基是谁呢？

蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(包括苏氨酸)，另一种是酪氨酸

Q4: 蛋白质磷酸化的作用？

蛋白质磷酸化是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。

好啦，知道蛋白质磷酸化是怎么一回事，那通过什么手段检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平呢？那常用到的方法就是western blot啦，有人会说western blot还不好做吗？那可是研究生的技能标配，但是磷酸化蛋白的western blot就不能小看了，多少人在这里摸爬滚打，绞尽脑汁。好了下面重点来了，赶紧搬个小板凳认真学起来。

收蛋白样：

1、   收蛋白样一定冰上操作，动作要快，防止磷酸化蛋白的降解；

2、   蛋白裂解液配置：蛋白裂解液RAPI：蛋白酶抑制剂PMSF=100:1, 因为蛋白裂解液RAPI中含有NaF（抑制酸性磷酸酶），所以不加磷酸酶抑制剂也是可以跑出很漂亮的条带;

3、   如果自己配置的蛋白裂解液不含磷酸酶抑制剂，为了防止磷酸化蛋白的降解，可根据需要另行添加磷酸酶抑制剂（氟化钠NaF：抑制酸性磷酸酶，使用浓度10mM; 正钒酸钠Na3VO4：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM；焦磷酸钠Na2P2O4：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM）；

4、   蛋白裂解后4℃离心后，最好立即加入loading buffer进行煮沸变性，也是防止磷酸酶降解磷酸蛋白。蛋白变性后你就可以稍微心安了，不用再小心翼翼害怕磷酸化蛋白降解了。

转膜：

转膜的时间根据磷酸化蛋白的大小，分子量大时间就长点；分子量小，时间就短点，不可转膜不完全，也不可把膜转过头了。这样都将导致磷酸化蛋白量少，条带过淡。

封闭：

1、常温封闭即可，转速不可过高，40-50转即可；

2、做一般蛋白的话，我们常用5%的脱脂奶，但如果做磷酸化的蛋白，最好用5%的BSA。

抗体：

1、   一定选大公司的抗体，比如CST，毕竟磷酸化蛋白不好做，以免费时费力，小心翼翼很多步，最后毁在抗体上，得不偿失；

2、   一抗最好最好4度过夜，确保抗体充分的结合；

3、   二抗正常室温2h，转速不可过大；

4、做磷酸化蛋白，最好总蛋白水平也跑一下，因为到时候发文章评委也会提这样的问题，避免以后补实验，不要给自己找麻烦啊！这是为什么呢？评委难为我，No, No, No!那是因为总蛋白水平包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，蛋白的磷酸化激活是体内磷酸化蛋白占总蛋白的比值，而不是单一看磷酸化蛋白的表达，磷酸化蛋白的改变是因为处理某种作用下总蛋白表达的变化所引起的，还是蛋白激酶活化磷酸化蛋白水平增加而引起的。

曝光：

加ECL显影剂，如果条带过淡，可延长曝光时间；如果杂带过多影响目的条带的额曝光，可遮住杂带部分再次曝光。

按照以上要求，请给磷酸化蛋白多一点关爱，那么你就离paper不远了！

---