循环肿瘤DNA与结直肠癌的靶向治疗

循环肿瘤DNA与结直肠癌的靶向治疗

黄玉庭 徐建明 

中华肿瘤杂志, 2018,40(3) : 161-165

转移性结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，结肠癌和直肠癌存在生物学行为的差异^[1]，传统化疗不能取得令人满意的效果，即使是靶向药物的加入也往往因耐药限制了有效性。目前，常通过检测肿瘤组织相关的基因突变预测靶向药物的疗效，但存在诸多限制。肿瘤异质性使得单次组织活检并不能完整地代表整体基因改变^[2]。外周血作为一个可实时检测的液体活检样本，因取样方便、无创，能开展相应分子标志物检测，目前正受到临床和科研人员的青睐。液体活检用于诊断或检测肿瘤疾病的方法较多，其中循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)能够真实地反映实体瘤组织中的基因突变谱与突变频率，且能实时动态地反映肿瘤的基因改变^[3]，即将在多种肿瘤中取代肿瘤组织作为预测靶向药物疗效的样本。

一、ctDNA的生物学特性及其临床应用

1．ctDNA的生物学特性：

20世纪40年代，Mandel和Metais^[4]发现了循环核酸，循环核酸是由机体细胞释放入外周血循环后发生部分降解的内源性核酸。20世纪70年代，Leon等^[5]的研究结果显示，肿瘤患者外周血清DNA(cell－free circulating DNA, cfDNA)的水平明显高于正常人。20世纪80年代，Stroun等^[6]的研究结果显示，cfDNA具有肿瘤细胞DNA的一些特征，通过对cfDNA中肿瘤特异性畸变(如肿瘤原癌基因和致癌基因突变、微卫星改变和DNA甲基化)的识别，证实其为肿瘤细胞来源的cfDNA，即ctDNA。ctDNA是一类来源于肿瘤细胞的DNA片段，携带有与原发肿瘤组织一致的分子遗传学改变，长度约150～200 bp，含量极少，浓度约5 ng/ml，半衰期约0.5～2 h，主要存在于血液、滑膜液和脑脊液等液体中，可经尿液和粪便排出。健康人群的cfDNA片段主要来源于凋亡细胞，ctDNA主要来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞，增殖活跃的肿瘤细胞能主动释放DNA片段到外周循环中。

2．ctDNA的临床应用：

ctDNA应用于临床具有快速、简便的特点，只需采集静脉血，即可对全身的肿瘤基因信息进行测定，用于肿瘤的早期发现和诊断、动态监测肿瘤的发生发展、指导抗肿瘤药物的选择、疗效评估和预后判断等，同时可从中探索肿瘤转移复发和耐药的分子机制，鉴别和筛选新的靶点等。ctDNA可以出现在大部分转移性结直肠癌患者中^[7,8,9]，这使得结直肠癌靶向表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)药物的个体化治疗成为可能。

二、ctDNA的定量检测

ctDNA的检测方法包括数字聚合酶链反应(dPCR)、SafeSeqS、珠乳扩磁技术(BEAMing)、实时荧光定量PCR和高通量测序、标记扩增深度测序(TAM－Seq)、全基因组测序、全外显子测序、恶性肿瘤个体化深度测序(CAPP－Seq)等。其检测分为定性和定量2种，定性检测主要检测血清或血浆中肿瘤特异性的基因改变，如基因突变、抑癌基因启动子甲基化等；定量检测则以血液循环DNA总量为指标，两者均可反映肿瘤的存在和严重程度。

有研究显示，不同患者外周血ctDNA的水平差异明显^[7]。Newman等^[10]的研究结果显示，ctDNA的水平与肿瘤患者体内肿瘤负荷明显相关。当肿瘤患者对治疗反应良好时，ctDNA的浓度呈下降趋势；相反，当肿瘤进展时，ctDNA的浓度不断上升，同时ctDNA中也出现某些特异性基因改变。Tie等^[11]的研究结果显示，可通过SafeSeqS技术定量检测治疗前后ctDNA的水平变化来评估肿瘤患者对治疗的反应。该研究纳入53例接受标准一线化疗的转移性结直肠癌患者，定量评估化疗前后的ctDNA水平变化。结果显示，化疗前中位ctDNA水平为16.2%，化疗3 d后中位ctDNA水平为14.7%，差异无统计学意义(P＝0.139)；而在第2个周期化疗前ctDNA水平就有了明显下降(0.54%，P<>

除定量监测ctDNA的水平变化外，定量监测ctDNA中基因突变水平的变化也可以评估结直肠癌患者对EGFR单抗治疗的反应。Siravegna等^[12]通过测定结直肠癌患者不同时间点的K－ras基因突变百分比发现，当加入EGFR单抗后，随着治疗时间的延长，K－ras基因突变量逐渐增加，终止治疗后K－ras基因突变量便开始下降，直到无法检测。由此可见，ctDNA中的基因突变水平也呈现出动态改变。此外，Spindler等^[13]发现，ctDNA中K－ras、鼠类肉瘤滤过性病毒原癌基因同源体B1(v－raf murine carcoma viral oncogene homologue B1，BRAF)基因突变与cfDNA存在明确的相关性。当cfDNA水平较低时，常无法检测到ctDNA中的基因突变，但随着靶向治疗的延续，这些基因突变又会重现。由此可见，充足的cfDNA水平是ctDNA检测的必要前提。只有当存在足够的cfDNA时，方可进一步进行ctDNA检测。Spindler等^[14]在另一项研究中发现，可供检测ctDNA基因突变的cfDNA水平最低限是每毫升血液中存在3 000个等位基因片段。

在靶向EGFR单抗治疗过程中，结直肠癌患者的ctDNA基因突变水平呈现出动态改变，既然这是一个动态变化的量，那么是否存在一个导致临床耐药的基因突变频率阈值。若能明确这个阈值，我们便可以通过检测血液中ctDNA耐药基因突变频率，定量耐药的发生情况，就像常规化验肝肾功能一样，只需抽取1次静脉血就可评估肿瘤患者是否耐药。尽管目前的技术在ctDNA中筛选出有价值的基因突变并不难，但是要明确与耐药有关的基因突变频率阈值，尚需进一步研究。

三、ctDNA与结直肠癌靶向EGFR单抗治疗

EGFR单抗包括西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)，其在治疗转移性结直肠癌方面取得了良好的效果，然而几乎所有的患者在治疗后均会发生耐药。其中原发性耐药，如RAS家族突变的患者不能使用EGFR单抗。而继发性耐药通常发生在靶向治疗后的3～12个月，限制了EGFR单抗的临床获益。

1．ctDNA与原发性耐药：

在临床上选择靶向EGFR单抗治疗之前，均需要对肿瘤组织进行RAS基因检测。Lecomte等^[15]探讨了37例转移性结直肠癌患者外周血ctDNA中K－ras基因突变在结直肠癌预后判断中的价值。结果表明，在EGFR单抗治疗之前，发生K－ras基因突变患者的2年生存率仅为48%，而无K－ras基因突变者的2年生存率可达100%。Cox回归分析的结果显示，ctDNA中K－ras基因突变是结直肠癌的独立预后因素，可通过治疗前血液中K－ras基因状态预测其对EGFR单抗治疗的疗效和预后。柏艳清等^[16]采用肽核酸钳制PCR(peptide nucleic acid－PCR，PNA－PCR)和传统巢式PCR法检测了血浆ctDNA中K－ras基因突变丰度与转移性结直肠癌患者疗效和预后的关系，106例转移性结直肠癌患者根据是否突变和突变丰度，分为野生型组、低丰度突变组和高丰度突变组，结果显示，PNA－PCR法检测的K－ras基因状态是结直肠癌患者的独立预后因素，根据突变丰度决定的血浆K－ras基因状态与预后明显相关，高丰度的K－ras基因突变与结直肠癌较差的预后明显相关。

Xu等^[17]对比分析了242例转移性结直肠癌患者肿瘤组织和血浆样本间K－ras基因突变与预后的关系，结果显示，K－ras基因突变与较差的预后相关，并且这与检测样本和测序方法无关，即基于血浆ctDNA的K－ras基因突变分析具有可行性，且与肿瘤组织所包含的信息相一致。此外，研究结果还显示，部分患者肿瘤组织与血浆ctDNA间的K－ras基因状态存在不一致。Spindler等^[18]对17例肿瘤组织中存在K－ras基因突变而血浆ctDNA中无该突变的结直肠癌患者进行研究，按照目前的标准，这些患者不适用于EGFR单抗治疗，但是其中3例患者对EGFR单抗治疗有反应，大部分表现为疾病稳定。并且，在血浆ctDNA中检测到K－ras基因突变者的无进展生存时间和总生存时间更短。由此可见，ctDNA所携带的分子生物学信息与肿瘤组织相一致，能够很好地替代肿瘤组织。此外，ctDNA能克服肿瘤异质性、全面反映肿瘤的整体基因组信息，可提供更多肿瘤组织无法提供的信息。因此，临床医师可以根据肿瘤患者血浆ctDNA中的基因突变状态来筛选出适合EGFR单抗治疗的患者。

然而，一些K－ras野生型的结直肠癌患者也可能对EGFR单抗没有反应。随着检测技术的发展，陆续证明，NRAS突变、BRAF突变、PIK3CA突变、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor2, HER2)扩增、MET扩增、K－ras扩增及PTEN表达缺失均可致原发性耐药，所有的这些基因改变都是EGFR信号传导通路的组成部分或者与该通路相互作用。除了以上这些阴性预测指标外，EGFR基因拷贝数可作为阳性预测指标来预测结直肠癌对靶向治疗的反应性，基因拷贝数越高、反应越良好。此外，人表皮生长因子受体3(human epidermalgrowth factor receptor3, HER3)及类胰岛素生长因子1(insulin－like growth factor1, IGF1)过度表达也可能导致了原发性耐药。甚至表观遗传学改变也有助于我们预测结直肠癌患者的疗效和预后^[19]。

2．ctDNA与继发性耐药：

即使是最初对EGFR单抗治疗有反应的结直肠癌患者，多数均会在治疗后的3～12个月相继出现耐药，导致疾病进展^[20,21]。Misale等^[22]的研究结果显示，10例RAS野生型结直肠癌患者在接受EGFR单抗治疗后，1例发生了K－ras扩增，6例发生了K－ras突变。通过一系列血浆样本ctDNA分析发现，K－ras基因突变的出现早于影像学发现疾病进展前10个月。Diza等^[23]也得出了相似的结论，其选取了24例K－ras野生型转移性结直肠癌患者，予以帕尼单抗治疗，其中9例发生了耐药，通过检测耐药患者的血浆ctDNA，发现了K－ras基因突变，其中有3例同时发生了多种不同的基因突变。以上研究表明，ctDNA不仅可敏感地发现导致继发性耐药的基因改变，更重要的是，它可以比影像学检查更早地预示疾病耐药。一旦肿瘤发生了某种有作用基因的改变，最终不可避免地会出现临床耐药，影响靶向治疗的有效性。通过ctDNA检测能早期发现耐药基因改变，及时终止治疗，减少不必要的无效治疗和药物副作用。

在RAS野生型结直肠癌患者中，是否存在少量已经发生基因突变的肿瘤细胞呢？Diza等^[23]通过数学建模推理验证了上述假设。他们对结直肠癌患者的血液进行ctDNA分析，结合肿瘤细胞的生长特性，估算肿瘤生长率，建立肿瘤在治疗过程中发生发展的数字模型。通过这个模型，他们反推发现，K－ras基因突变在治疗前即以低频亚克隆形式存在，只是因为常规活检或病理评估的缺陷而未能检出。因此可以推断，继发性耐药的发生极有可能是在EGFR单抗的药物压力之下，使预先存在的亚克隆突变发生扩增所导致的，当然，这并不能排除继发性耐药也可以在靶向治疗过程中所获得。Morelli等^[24]的研究结果也显示，在接受EGFR单抗治疗的结直肠癌患者血浆ctDNA中，新发现的K－ras突变和EGFR突变似乎是来源于肿瘤中预先存在的少量突变。这些低频亚克隆突变是否与后续发生的临床耐药有着绝对或相对的关系，是否存在其他基因突变导致的耐药，尚不明确。值得注意的是，相对于肿瘤中预先存在的少量低频K－ras突变，后续在血浆ctDNA中检测到的K－ras突变和EGFR突变水平均较治疗前有所下降，这表明该基因突变并没有完全主导整个肿瘤的遗传学改变。如前所述，同一肿瘤患者体内也可同时出现多种基因改变。在药物、环境等外部因素的影响下，肿瘤的基因组可能处在不断变化之中，基因改变呈现出多样性。那些介导原发性耐药的机制同样可以导致继发性耐药^{[25,26,27,28]}。在原发肿瘤中检测到的基因突变并不一定就是后续导致临床耐药的突变，其在治疗过程中可能消失，也有可能产生了新的基因突变，同时其突变频率呈现动态改变。

四、基于ctDNA指导下的靶向药物联合治疗

既然肿瘤耐药已成事实，如果能明确导致耐药的基因改变就可以促使我们合理地选择治疗方案。结直肠癌靶向EGFR治疗耐药的基因改变形式多种多样，甚至在同一患者体内也可以出现多种不同的耐药基因改变。因此，多靶点抗肿瘤药的开发和联合应用显得尤为重要。多个研究表明，BRAF V600基因突变对BRAF抑制剂及MEK抑制剂均敏感^[29,30]。Corcoran等^[31]对发生BRAF V600E基因突变的结直肠癌细胞模型予以MEK抑制剂AZD6244治疗，最开始有治疗反应，但最终发生了疾病进展。结果显示，BRAF基因扩增介导了肿瘤细胞对MEK抑制剂的耐药，更重要的是BRAF基因扩增也介导了对BRAF抑制剂AZ628和PLX4720的耐药。进一步研究显示，联合BRAF抑制剂AZ628和MEK抑制剂AZD6244治疗可以恢复耐药细胞对MEK抑制剂的敏感性。因此，联合MEK抑制剂和BRAF抑制剂可以有效地阻止耐药的发生。Misale等^[28]也通过研究证实，在发生EGFR单抗耐药后，联合EGFR单抗和MEK抑制剂AS703026可以使耐药细胞恢复对EGFR单抗治疗的敏感性。

基于结直肠癌基因改变的多样性，无论是原发耐药还是继发耐药，我们均可以通过ctDNA及时、准确地检测出基因改变，及早在耐药发生之前联合治疗，亦或在耐药发生之后及时补救治疗。在靶向治疗前，检测血浆ctDNA中所发生的基因改变，若发现多重基因改变，则早期予以联合靶向治疗；在靶向治疗过程中，动态监测ctDNA变化，当出现新发基因改变时，及时加入该基因抑制剂，延缓甚至逆转耐药的发生。可以预测，未来几年，基于ctDNA指导下的联合靶向药物治疗必将给人们带来一个新的视野。

ctDNA的检测使转移性结直肠癌的个体化靶向治疗成为可能，顺应了当前肿瘤精准医学时代的潮流。随着肿瘤分子生物学研究的进展，ctDNA的检测及其生物学指标的研究，在肿瘤的早期诊断、预后判断、疗效评估及耐药监测等方面具有广阔的应用前景。然而，如何将ctDNA检测转化于临床，还面临诸多难题。一方面，外周血中ctDNA含量相对较低，现行的检测技术存在敏感性或特异性低、价格昂贵等问题，迫切需要建立一个新的敏感、快速、廉价的标准化ctDNA检测方法。同时，各种检测技术所检测的DNA靶标不同，缺乏一致性，需制备相关质控品应用于全国各级医院，以进行高通量测序的质量评价，从而将ctDNA检测水平标准化。与肿瘤组织比较，ctDNA中特定基因改变检出的可靠性及稳定性尚需进一步验证。另一方面，如何解读ctDNA与影像学、病理学等传统诊断方法的不一致，需要我们进一步的探索研究。尽管如此，ctDNA在肿瘤的诊断、治疗和预后等方面已崭露头角，将有望颠覆肿瘤治疗领域。